Production and Characterization of New Baeyer-Villiger Monooxygenases

La reazione di Baeyer-Villiger è una reazione di ossidazione di grande interesse sintetico in chimica organica e consiste nella conversione di composti carbonilici nei corrispondenti esteri o lattoni. L'approccio classico per eseguire la reazione di Baeyer-Villiger prevede l'utilizzo di agenti ossidanti quali perossidi o perossiacidi; questi catalizzatori sono tuttavia il più delle volte intrinsecamente insatabili e/o tossici mancando anche di enantioselettività. Ciò ha portato allo sviluppo di differenti sistemi catalitici che hanno implementano il concetto di "green chemistry" quali gli enzimi, utilizzati come biocatalizzatori. Gli enzimi che in natura catalizzano la reazione di Baeyer-Villiger sono flavoenzimi chiamati "Bayer-Villiger monoossigenasi" (BVMOs). Ad oggi solo pochi geni codificanti per le BVMOs sono stati clonati ed espressi e ciò ha rappresentato sicuramente un grosso ostacolo verso l'applicazione industriale di questa classe di enzimi. Attraverso un'analisi bioinformatica è stato possibile identicare cinque sequenze codificanti proteine ritenute BVMOs putative, le quali presentano al loro interno il motivo caratteristico delle BVMOs di tipo I (FxGxxxHxxxW). Gli organismi individuati sono stati i seguenti: Oryza sativa (pianta), Physcomitrella patens (muschio), Cyanidioschyzon merolae (alga rossa), Trichodesmium ery-thraeum (cianobattere), Haloterrigena turkmenica (archeobattere). In particolare gli eucarioti fotosintetici Oryza, Physcomitrella e Cyanidioschyzon risultano fonti di BVMOs alquanto inusuali, considerando che fino ad oggi questi enzimi sono stati identificati solamente in batteri e funghi. La strategia di clonaggio e di espressione utilizzate è stata la stessa per tutte e cinque le sequenze identificate. La bassa solubilità delle proteine espresse si è rivelata il fattore limitante di tutto il lavoro. Le strategie utilizzate per migliorare la solubilità proteica sono state quelle che hanno portano a una diminuzione della velocità della sintesi proteica come ad esempio la diminuzione della temperatura di crescita di coltura e la diminuzione della concentrazione dell'induttore. Un fattore risolutivo è stato l'aggiunta al terreno di coltura di riboflavina, il precursore del FAD, il quale ha permesso di ottenere in forma solubile le proteine putative da Physcomitrella patens e Cyanidioschyzon merolae, dimostrando inoltre l'importanza del cofattore flavinico nel processo di ripiegamento proteico. La caratterizzazione biocatalitica delle proteine espresse è stata eseguita presso il gruppo di Biocatalisi del Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute (GBB), University of Groningen (The Netheralnds), guidato dal Prof. Dr. M.W. Fraaije, esperto in flavoproteine. Confermata la loro attività come Baeyer-Villiger monoossigenasi è stata eseguita un'ottimizzazione delle condizioni di reazione (in termini di pH, temperatura e stabilità) ed è stata investigata la loro specifità di substrato. In seguito sono stati determinati i parametri cinetici per ciascun enzima e infine sono state eseguite delle bioconversioni con diversi substrati per capire il loro profilo di selettività. Il lavoro riportato ha portato alla scoperta di nuove Baeyer-Villiger monoossigenasi di tipo I, ampliando il panorama di nuovi promettenti biocatalizzatori ossidoriduttivi.