Role of microRNAs in T-cell activation and transformation by human T-cell Leukemia virus type 1

Il virus T-linfotropico umano di tipo 1 (HTLV-1) è l’agente eziologico della leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto (ATLL, adult T-cell leukemia/lymphoma) e della paraparesi spastica tropicale/mielopatia associata ad HTLV (TSP/HAM, Tropical spastic paraparesis/HTLV-associated myelopathy), una patologia degenerativa del sistema nervoso centrale. Recenti evidenze suggeriscono che i microRNA (miRNA) contribuiscano a questo processo di trasformazione mediata da HTLV-1. Le ricerche condotte nel corso del mio dottorato sono state mirate ad approfondire il ruolo dei microRNA (miRNA) nell’infezione di cellule T da parte di HTLV-1 e nella patogenesi dell’ATLL. Sono state realizzate librerie di cDNA di piccoli RNA, a partire da linfociti T CD4+ normali (resting e attivati) e da due linee cellulari cronicamente infettate con HTLV-1 (C91PL e MT-2). Le librerie sono state analizzate attraverso il sequenziamento di massa 454 e l’analisi bioinformatica delle sequenze ottenute ha permesso l’identificazione dei miRNA noti e nuovi miRNA candidati presenti in ciascuna libreria. Il confronto delle frequenze dei miRNA noti nelle diverse librerie ha evidenziato la presenza di 14 e 4 miRNA rispettivamente downregolati e upregolati nelle linee cellulari infettare rispetto ai linofociti T CD4+ resting, mentre 21 miRNA sono risultati differenzialmente espressi in linfociti T CD4+ stimolati in confronto ai linfociti T CD4+ resting (16 downregolati, 5 upregolati). L’espressione di diversi nuovi miRNA, individuati dall’analisi bioinformatica delle librerie, è stata validata attraverso RT-PCR end-point o RT-PCR quantitativa. Inoltre la nostra analisi ha rivelato nelle librerie da cellule infettate 2 sequenze che mappano in regioni trascritte del genoma di HTLV-1 e che potrebbero rappresentare dei miRNA virali. Attraverso l’impiego di microarray il profilo di espressione dei miRNA noti è stato analizzato in pazienti ATLL e in linfociti T CD4+ resting e stimolati. In base ai profili di espressione di miRNA ottenuti i campioni sono stati raggruppati in cluster che indicano una forte similitudine all’interno dei campioni di linfocititi T CD4+ resting, mentre i campioni di ATLL hanno profili di espressione di miRNA più eterogenei. L’analisi statistica ha evidenziato 21 miRNA downregolati e 6 upregolati nei pazienti ATLL vs linfociti T CD4+ resting. Diversi miRNA differenzialmente espressi identificati attraverso l’analisi delle librerie e dei microarray sono stati validati tramite RT-PCR quantitativa. Dal momento che l’interazione miRNA-mRNA spesso comporta la degradazione del messaggero bersaglio, l’analisi integrata dei risultati dei programmi di predizione di bersagli con i profili di espressione di miRNA e geni può aiutare nell’identificazione di target. Abbiamo applicato questo approccio ai dati di espressione di miRNA e geni ottenuti per i nostri campioni di ATLL e linfociti T CD4+ resting. Dall’integrazione dei profili di espressione di miRNA e mRNA sono stati identificati i target putativi per 12 miRNA differenzialmente espressi nei pazienti ATLL. L’arricchimento funzionale dei geni bersaglio predetti ha evidenziato la presenza di diversi geni coinvolti nella via di segnale di cAMP, noto per essere presente ad alti livelli in cellule trasformate da HTLV-1. Infine abbiamo indagato il significato funzionale di miR-34a, che risulta essere consistentemente upregolato in pazienti ATLL e linee cellulari infettate. Il silenziamento di miR-34a in linee cellulari infettate determina un aumento della morte cellulare, suggerendo che la deregolazione di questo miRNA possa svolgere un ruolo importante nell’espansione della popolazione di cellule infettate da HTLV-1 e quindi nello sviluppo dell’ATLL.