Effetti del knockdown del recettore degli estrogeni β2 (esr2a) sullo sviluppo di Danio rerio

RIASSUNTO Il mio lavoro di tesi si è focalizzato sullo studio del ruolo svolto dagli mRNA ovocitari di origine materna codificanti la forma erβ2 (esr2a) del recettore degli estrogeni nella modulazione epigenetica a lungo termine dello sviluppo in zebrafish (Danio rerio). Crescenti evidenze indicano che gli ormoni steroidei possono partecipare alla programmazione materna nei processi di sviluppo dei pesci (Auperin e Geslin, 2008) e dei mammiferi (Darnaudéry e Maccari, 2007). In particolare, gli estrogeni secreti dalle cellule della granulosa durante la vitellogenesi possono essere accumulati negli ovociti dei pesci (Hines et al., 1999) con un possibile ruolo di programming iniziale avente effetti profondi sulla ontogenesi successiva. Nel presente lavoro sullo zebrafish, è stato osservato mediante ibridazione in situ che i livelli di espressione degli mRNA che codificano per il recettore Esr2a sono alti negli oociti ovulati e nell'embrione subito dopo la fecondazione. La concentrazione di questi trascritti diminuisce nelle 8 ore che seguono la fecondazione (hpf), per poi riprendere a crescere dopo l'inizio della trascrizione embrionale, confermando precedenti dati di qRT-PCR (Pikulkaew et al., 2010). Il ruolo funzionale del gene esr2a è stato studiato mediante silenziamento genico ottenuto con la tecnologia del morfolino antisenso utilizzando due diversi morfolini microiniettati nelle uova appena deposte: il primo, progettato sull'ATG d'inizio traduzione, determina il knockdown mediante blocco della traduzione dei trascritti di origine materna e zigotica (esr2aATGMO), mentre il secondo interferisce nel corretto processo di splicing per bloccare la maturazione post-trascrizionale del solo messaggero zigotico (esr2aSPLICMO). Gli embrioni ottenuti dopo microiniezione di esr2aATGMO presentano numerose alterazioni morfologiche rispetto agli embrioni non iniettati (WT) o microiniettati con morfolino standard di controllo (StdMO) e muoiono tra i 12 e i 14 giorni dopo la fecondazione (dpf). Il fenotipo morfante è caratterizzato da: ritardo nella crescita corporea, forma ricurva, anormale sviluppo di cervello e splancnocranio, cavità pericardica ampia ed emorragica, vescica natatoria non insufflata, pinna caudale rudimentale e anomala natazione circolare. La specificità degli effetti ottenuti con la microiniezione è stata verificata anche mediante coiniezione, con l'esr2aATGMO, di un morfolino inattivante la proteina p53. Il fenotipo ottenuto silenziando anche p53 corrisponde a quello morfante; questo dimostra che gli effetti di esr2aATGMO sono specifici e non collegati ad un'iperattivazione di p53 causata dall'iniezione. E' stato possibile inoltre riottenere il fenotipo WT mediante la coiniezione con l'esr2aATGMO del trascritto di zebrafish per Esr2a mutato nella regione complementare al morfolino. Questo dimostra che il legame dell'oligonucleotide al target è estremamente specifico. Per approfondire in maniera più dettagliata la funzione del gene esr2a ho eseguito un esperimento di gain of function con il quale ho aumentato la concentrazione del trascritto del recettore. In un esperimento successivo ho iniettato l'mRNA per esr2a e trattato le uova con 17β-estradiolo (E2) per osservare eventuali anomalie nei primi giorni dopo la fecondazione. Dalla microiniezione di esr2aSPLICMO si ottengono embrioni con fenotipo paragonabile ai controlli. Questo morfolino interferisce nel processo di maturazione del messaggero zigotico, portando alla perdita del terzo esone e a una proteina tradotta non funzionante. Il risultato che ho ottenuto E' un dato importante, perchè suggerisce come le variazioni osservabili nel fenotipo esr2aATGMO siano imputabili principalmente all'inattivazione del trascritto materno. Un'analisi mediante ibridazione in situ utilizzando marcatori di sviluppo ha evidenziato nei morfanti esr2aATGMO una possibile up-regolazione di empty spiracles homeobox 1 (emx1) e sine oculis homeobox homolog 3a (six3a) a 24 e 48 hpf e di sonic hedgehog a (shha) a 48 hpf. La colorazione con alcian blu delle cartilagini craniche ha rivelato un pattern alterato a 6 dpf. Le successive analisi mediante in situ di alcuni marcatori della regione cranica hanno evidenziato un profilo di espressione lievemente differente tra WT e morfanti per il gene distal-less homeobox gene 2a (dlx2a) a 48 hpf e di neurogenic differentiation (neurod) a 24 hpf. Un'analisi di microarray two-color sul genoma totale di zebrafish è stata utilizzata per studiare l'espressione genica su embrioni di 8 e 48 hpf trattati con esr2aATGMO rispetto ai controlli iniettati con StdMO. Con l'analisi microarray a 8 hpf, si possono evidenziare le variazioni nell'espressione dovute principalmente al knockdown del recettore materno. L'analisi a 48 hpf permette invece di rilevare effetti del morfolino dovuti all'inattivazione anche dei trascritti embrionali. L'analisi pangenomica di microarray a 8 hpf, ha individuato 237 trascritti significativamente up-regolati e 219 down-regolati a causa dell'assenza del recettore Esr2a materno negli embrioni iniettati con esr2aATGMO. A 48 hpf, 165 e 124 trascritti, presumibilmente zigotici, sono rispettivamente up-e down-regolati. Tra questi solo 8 sono in comune con quelli up-regolati a 8 hpf e 17 con quelli down-regolati. E' interessante osservare la presenza di un'up-regolazione dei trascritti implicati nella regolazione negativa della proliferazione cellulare. Si può ipotizzare che l'assenza di Esr2a porti ad una diminuzione della proliferazione cellulare, forse dovuta ad un aumento dell'apoptosi. Il dato è in accordo con i risultati del saggio di morte cellulare, mediante TUNEL, che ha evidenziato un numero di cellule apoptotiche nei morfanti notevolmente aumentato e concentrato nell'area cerebrale a 24 e 48 hpf. L'analisi della vascolarizzazione embrionale sfruttando l'attività vasale della fosfatasi alcalina endogena e mediante l'utilizzo della linea transgenica TG(fli1:EGFP) a 3 e 6 dpf ha mostrato nei morfanti esr2aATGMO una netta diminuzione dei vasi subintestinali ed un pattern di distribuzione dei vasi lungo il tronco e la coda meno definito. I risultati ottenuti suggeriscono che nello sviluppo di zebrafish sia presente un controllo epigenetico dipendente dall'mRNA materno di Esr2a e da un'interazione con gli estrogeni di eredità materna.