La ciclofilina D come bersaglio farmacologico: suoi potenziali inibitori peptidici

Il poro di transizione mitocondriale (MPTP) gioca un ruolo chiave nel processo di morte cellulare mediata dal mitocondrio (apoptosi). Molecole in grado di inibire il MPTP possono dunque essere dei potenziali agenti terapeutici, utili nel trattamento di patologie come il trauma, il danno da ischemia/riperfusione, le malattie di Parkinson e Alzheimer e in generale di tutte quelle condizioni in cui è coinvolto lo stress ossidativo e che portano all’apoptosi. La ciclofilina D (CypD), una peptidil-prolil isomerasi della famiglia delle ciclofiline, è una proteina della matrice mitocondriale che è strettamente implicata nella regolazione della transizione aperto-chiuso dell’MPTP. Il meccanismo con cui esplica la sua azione non è ancora conosciuto. Vi sono però delle evidenze che mettono in luce il suo ruolo fondamentale nella modulazione della permeabilità mitocondriale. CypD, così come altri membri della famiglia delle ciclofiline, è il bersaglio principale della ciclosporina A (CsA), un undecapeptide ciclico estratto dal fungo Tolypocladium inatum, che ha rivoluzionato la pratica dei trapianti prevenendo le reazioni di rigetto. CsA infatti è ben nota per la sua potente azione immunosoppressiva che si esplica mediante la formazione di un complesso ternario con una ciclofilina e la calcineurina (Cn), una Ser/Thr fosfatasi Ca2+/calmodulina dipendente. Cn, attraverso la defosforilazione del fattore nucleare di attivazione delle cellule T, è fortemente coinvolta nelle vie del segnale che attivano la risposta immunitaria. CsA complessa con una ciclofilina e il complesso CsA-Cyp si associa con Cn, inibendone l’attività enzimatica. Studi di ablazione genica della CypD mostrano un’inibizione della permeabilità mitocondriale. Inoltre il trattamento con la CsA migliora, attraverso l’interazione con CypD e quindi l’inibizione dell’MPTP, le condizioni di diverse patologie legate alla disregolazione mitocondriale in modelli animali. Tutte queste evidenze convalidano l’ipotesi che inibire CypD sia una buona strategia terapeutica. Il maggior problema inerente all’uso di CsA come inibitore di CypD è la sua azione immunosoppressiva, che ne limita l’impiego in quanto è possibile somministrarla solo per brevi periodi di tempo. Infatti studi clinici preliminari effettuati su pazienti affetti da distrofia di Ullrich e miopatia di Bethlem hanno dato risultati incoraggianti, ma in poche settimane i pazienti sono diventati immunodepressi e quindi esposti al rischio potenziale di contrarre pericolose infezioni. Un altro problema è che la CsA, nonostante la sua lipofilia, non raggiunge adeguate concentrazioni nel sistema nervoso centrale, in particolare nel cervello, dopo somministrazione sistemica, in quanto non riesce a permeare adeguatamente la barriera emato-encefalica. Alla luce di queste considerazioni appare chiaro che la CypD sia un bersaglio farmacologico di grande interesse e che l’ottenimento di ligandi privi di attività nei confronti della Cn e in grado di raggiungere concentrazioni elevate nel sistema nervoso centrale, sia una condizione promettente per lo sviluppo di agenti terapeutici in grado di controllare una gran varietà di disturbi o patologie. Un altro peptide ciclico con struttura riconducibile alla CsA è l’antamanide (Anta). L’Anta è un ciclodecapeptide non tossico isolato dal fungo Amanita phalloides. Molte delle ricerche condotte su questa molecola sono state rivolte allo studio della sua attività in relazione alla sua capacità di formare complessi con metalli alcalini e alcalino-terrosi, principalmente Na+ e Ca2+, che sono poi stati studiati da un punto di vista strutturale e funzionale. Come la CsA e il ciclolinopeptide A, un ciclononapeptide estratto dai semi di lino, l’Anta possiede una certa attività immunosoppressiva, che risulta però inferiore a quella della CsA. Lo scopo di questo lavoro è l’ideazione, la sintesi chimica e la caratterizzazione, mediante NMR, delle interazioni atomiche con la proteina, di inibitori peptidici della CypD e più specificatamente dell’Anta e suoi derivati. L’obiettivo è quello di identificare nuovi ligandi che non risultino immunosoppressivi. L’Anta è stata scelta come base di partenza per le caratteristiche comuni alla CsA, per il fatto di avere un’attività biologica intrinseca e per la capacità di chelare ioni Ca2+ che giocano, anch’essi, un ruolo importante nella regolazione dell’MPTP. Per questo motivo abbiamo sintetizzato l’Anta e alcuni suoi derivati in cui i residui di Phe in posizione 6 e 9 sono sostituiti alternativamente da residui di Gly di Tyr. Inoltre abbiamo sintetizzato due ottapeptidi in cui mancano le Phe in posizione 5 e 6 e in posizione 9 la Phe è stata sostituita da Gly e Tyr. Infine abbiamo ottenuto per espressione in E. coli la CypD marcata al 15N, così da poter effettuare esperimenti NMR bidimensionali eteronucleari. Tuttavia, le notevoli difficoltà riscontrate nel refolding della proteina non ci hanno permesso di ottenere le preziose informazioni che questa tecnica poteva offrire. Sui peptidi sono stati effettuati comunque dei saggi biologici in vitro, che hanno dimostrato come l’Anta sia un inibitore del poro di transizione mitocondriale e che questa azione si esplica attraverso l’inibizione della CypD. Inoltre abbiamo dimostrato che protegge dalla depolarizzazione mitocondriale e dalla morte cellulare. Infine possiamo affermare che le Phe 6 e 9 sono fondamentali per l’azione biologica su CypD, poiché tutti i suoi derivati si sono mostrati privi di attività.