Structural studies of protein kinase CK2: Inhibition mechanisms and structure-activity relationships

Il soggetto di questa tesi è la protein chinasi CK2, una famiglia di enzimi che negli uomini è composta da due subunità catalitiche, CK2α e CK2α’, e da una subunità regolatoria, CK2β. CK2 è una Ser/Thr protein chinasi acidofila altamente conservata nel mondo eucariote, presente in differenti compartimenti cellulari. CK2 è un membro della superfamiglia delle protein chinasi eucariotiche (EPKs), con la subunità catalitica correlata mediante omologia di sequenza e caratteristiche strutturali alle altre 478 chinasi della superfamiglia. CK2 mostra alcune caratteristiche singolari, come la sua elevata attività costitutiva e la mancanza di un importante meccanismo di regolazione, il quale rende CK2 unica rispetto alle altre chinasi. Con centinaia di substrati, CK2 è coinvolta in numerosi processi biologici, risultando essenziale per la vitalità cellulare: il knockout del gene CK2β nel modello murino è letale anche a livello di singola cellula, il knockout del gene CK2α è letale al giorno 10.5 dello sviluppo embrionale e il knockout CK2α' (espresso solo nel cervello e testicoli) in topo è vitale con alcuni difetti di spermatogenesi. CK2 partecipa alla progressione del ciclo cellulare, all'espressione genica, alla crescita cellulare e alla differenziazione e all’embriogenesi. Down-regulation di CK2 porta all'apoptosi cellulare mentre una sovra-attivazione anomala è stata trovata accoppiata a diverse malattie: la rilevanza clinica di CK2 risiede nel fatto che alti livelli di attività della proteina sono stati trovati in diversi tipi di tumori, come alla testa e al collo, ai reni, al seno, alla prostata e al polmone. Un ampio spettro di inibitori di CK2, permeabili alle cellule e specifici per il sito dell’ATP, sono attualmente disponibili e si stanno rivelando utili per analizzare le funzioni biologiche della proteina; queste piccole molecole sono in grado di indurre l'apoptosi delle cellule tumorali senza alcun effetto analogo sulle loro controparti "normali". Uno di questi inibitori, CX-4945, è recentemente entrato in studi clinici per il trattamento di tumori solidi avanzati, malattia di Castelman e mieloma multiplo. CK2 è considerato un enzima costitutivamente attivo e, a differenza di molte altre protein chinasi, non richiede fosforilazione per l'attivazione. Il meccanismo di regolazione di CK2 non è stato ancora stabilito, tuttavia è chiaro che si differenzia da quelli comunemente utilizzati dalle altre protein chinasi. Decine di strutture cristallografiche di CK2 sono state risolte e hanno evidenziato le caratteristiche strutturali delle principali entità di CK2: la subunità catalitica CK2α, la subunità regolatoria CK2β e l’oloenzima tetramerico CK2α2β2. Anche se la conoscenza strutturale di CK2 è molto estesa, non è disponibile alcuna struttura 3D a elevata risoluzione per la parte C-terminale di CK2α, che è sempre stata deleta per scopi di cristallizzazione. Inoltre, malgrado la struttura di CK2α' sia stata risolta, non sono presenti alcune informazioni strutturali per l’oloenzima tetramerico con questa subunità catalitica. Per raggiungere questo obiettivo, una parte del mio progetto di dottorato si è focalizzata sulla produzione e sulla caratterizzazione strutturale di CK2α wild type (completa della parte C-terminale) e di un mutante fosfomimetico nell’oloenzima tetramerico, al fine di studiare il possibile ruolo strutturale del C-terminale. Partendo da tre strutture dell’oloenzima risolte abbiamo potuto determinare alcune nuove caratteristiche strutturali dell’oloenzima, in particolare la nuova interfaccia di interazione tra le subunità all'interno del tetramero e la simmetria del complesso, finora sconosciuta. Inoltre ci siamo occupati dello sviluppo di un protocollo di purificazione dell’oloenzima CK2α’2β2 (e di una forma chimerica CK2αα’β2) in quantità appropriate per approcci strutturali. La seconda parte del dottorato si è focalizzata sulla caratterizzazione strutturale del complesso con un nuovo potente inibitore duale (K164) il quale è specifico per CK2 e Pim1; la struttura cristallina di CK2α336 in complesso con l’inibitore è stata risolta a 1.25 Å, che è la più alta risoluzione mai raggiunta per CK2.