Prevalence of KCNJ5 mutations and functional impact of a novel KCNJ5-insT149 mutation in aldosterone producing adenoma causing resistant hypertension

L’ iperaldosteronismo primario (PA) è la causa più frequente di ipertensione secondaria ed è caratterizzato da una secrezione elevata ed autonoma di aldosterone. Le due forme principali sono l’iperplasia surrenalica bilaterale e l’adenoma secernente aldosterone. I meccanismi molecolari alla base dell’ipersecrezione di aldosterone sono tuttora sconosciuti. Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che sostituzioni amminoacidiche all’interno del filtro di selettività del canale del potassio Kir3.4 (KCNJ5 possono provocare una secrezione autonoma di aldosterone in adenomi producenti aldosterone (APA). Tali mutazioni somatiche sono associate ad alti livelli plasmatici di aldosterone nei pazienti con APA, suggerendo un ruolo causale di tali mutazioni nello sviluppo di APA e iperaldosteronismo. Pertanto abbiamo condotto uno studio in pazienti affetti da APA afferenti a due centri di riferimento italiani, effettuando lo screening per le mutazioni somatiche di KCNJ5, ed abbiamo individuato e caratterizzato la mutazione KCNJ5-insT149, mai descritta in precedenza. Mediante analisi ad alta risoluzione delle curve di melting per le mutazioni in KCNJ5 sono stati studiati 195 pazienti consecutive con una diagnosi conclusiva di APA. Il 24,6% dei pazienti presentava una mutazione nel filtro di selettività del KCNJ5, tale prevalenza è stata confermata mediante sequenziamento Sanger. Nei pazienti affetti da mutazione di KCNJ5 l’espressione genica di CYP11B2 (29,9 ± 7,4 vs 10,3 ± 3,6, P <0,02), ma non quella di CYP11B1, risultava superiore rispetto ai pazienti non affetti da mutazioni, lo stesso valeva per l’indice di lateralizzazione. In un paziente con ipertensione farmaco-resistente grave è stata identificata l’ inserzione c.446insAAC, che codifica per la proteina mutante KCNJ5-insT149. Per caratterizzare funzionalmente questa nuova mutazione, attaverso mutagenesi sito-diretta, è stato generato un cDNA codificante per il canale KCNJ5 mutato e trasfettato in cellule di mammifero. Il cDNA codificante KCNJ3 è stato transfettato insieme a quello per KCNJ5 in modo da riprodurre la struttura tetramerica del canale KCNJ3/KCNJ5. CYP11B1, CYP11B2 e 17α-idrossilasi sono stati rilevati attraverso tecniche di immunoistochimica e immunofluorescenza nella ghiandola surrenale del paziente. L’espressione genica di CYP11B2 e le concentrazioni di aldosterone sono stati misurati per studiare l'impatto della mutazione sull'attività secernente. Utilizzando la tecnica di “whole-cell patch clamp e modeling molecolare” abbiamo studiato le correnti trans-membrana di Na+ e Ca2+ e generato una immagine 3D del canale insT149 KCNJ5. Rispetto al wild type e alle cellule adrenocorticali HAC15, le cellule transfettate con KCNJ5-insT149 esprimevano alti livelli del gene CYP11B2 e mostravano un’aumentata produzione di aldosterone. Allo stesso modo cellule HEK293 che esprimono il canale KCNJ5-insT149 mutato mostravano un aumento pari a due volte di Na+ intracellulare e un aumento sostanziale di Ca2+ intracellulare in seguito all’ attivazione dei canali del Ca2+ voltaggio-dipendenti. Quindi, la nuova mutazione del canale del K+ KCNJ5 induce un’anomala permeabilità della membrana al Na+, depolarizzazione della membrana, un aumento di Ca2+ intracellulare e aumento della sintesi di aldosterone. I nostri risultati nel complesso supportano il concetto che le canalopatie che coinvolgono il canale del K+ KCNJ5 sono alla base della secrezione costitutiva di aldosterone in pazienti affetti da APA.