ACUTE KETAMINE RESCUES CELLULAR AND MOLECULAR CHANGES INDUCED BY CHRONIC MILD STRESS IN VULNERABLE RATS

Increasing evidence has associated dysfunction of the glutamate system with the pathophysiology of stress-related neuropsychiatric disorders, including major depressive disorder. Clinical studies on depressed patients have shown consistent volumetric and functional changes in brain areas where glutamatergic transmission is predominant, such as hippocampus (HPC) and prefrontal and frontal cortex (PFC/FC). In parallel, preclinical studies on stress-based animal models of depression reported impaired glutamate neurotransmission and dendritic arborisation in the same brain regions affected in patients. Intriguingly, consistent evidence reported that a single sub-anaesthetic dose of the NMDA receptor antagonist ketamine (KET) induces rapid and sustained antidepressant effect, both in patients and in rodent models of depression. However, molecular mechanisms underlying KET therapeutic effect remain poorly understood. Using a chronic mild stress (CMS) rat model of depression, we aimed at studying the functional, morphological and molecular changes associated with fast antidepressant action of KET. Rats were subjected to CMS for 5 weeks. Sucrose preference test allowed to distinguish stress resilient (CMS-R) from vulnerable (CMS-V) rats. 10 mg/kg KET, acutely administered to CMS-V 24 hours before sacrifice, reversed anhedonic behavior. CMS induced significant phenotypic changes in all CMS rats, although the decrease in body weight gain and the increase of circulating corticosterone levels and adrenal glands weight were higher in CMS-V. A decrease in basal and depolarization-evoked glutamate release was selectively measured in HPC synaptosomes in superfusion from CMS-V, and in PFC/FC synaptosomes from CMS-R. Intriguingly, KET restored basal, but not depolarization-evoked, glutamate release in CMS-V. Area- and subcellular fraction-specific modifications in the expression and phosphorylation levels of selected proteins involved in glutamate release and stress response were measured by Western Blot in total homogenate, synaptosomes and synaptic membranes from HPC and PFC/FC. qPCR revealed a significant reduction in total-BDNF and BDNF splice variants transcripts in HPC and PFC/FC of all CMS rats, including those treated with KET. However, in situ hybridization studies found reduced dendritic trafficking of total-BDNF, and BDNF-2/BDNF-6 variants mRNAs in CA1 and CA3 of CMS-V, while KET treatment, although not reversing changes in BDNF mRNA levels, completely rescued dendritic trafficking in CA3 of CMS-V. Morphological analysis of CA3 pyramidal neurons in Golgi-Cox stained sections showed a reduction in total length and branching of apical, but not basal, dendrites. KET restored these changes to control levels. Overall, our results show that chronic exposure to mild stress induces functional and morphological alterations in HPC and PFC/FC of vulnerable rats. Interestingly, a single administration of KET was able to reverse most of these deficits.

Numerosi studi hanno associato la disfunzione del sistema glutammatergico con la fisiopatologia dei disturbi neuropsichiatrici correlati allo stress, compreso il disturbo depressivo maggiore. Studi clinici su pazienti depressi hanno mostrato variazioni volumetriche e funzionali in aree cerebrali dove prevale la trasmissione glutammatergica, come l'ippocampo (HPC) e la corteccia prefrontale e frontale (PFC/FC). In parallelo, studi preclinici su modelli animali di depressione basati sullo stress hanno osservato alterazioni della neurotrasmissione glutammatergica e dell'arborizzazione dendritica nelle stesse aree cerebrali coinvolte nei pazienti. Studi recenti hanno mostrato che una singola dose sub-anestetica di ketamina (KET), un antagonista del recettore NMDA, induce un rapido e sostenuto effetto antidepressivo, sia nei pazienti depressi, che nei modelli animali di depressione. Tuttavia, i meccanismi molecolari che sottendono l'effetto terapeutico di KET rimangono al momento poco conosciuti. Utilizzando il chronic mild stress (CMS), un modello animale di depressione, abbiamo studiato i cambiamenti funzionali, morfologici e molecolari associati all'azione antidepressiva rapida di KET. I ratti sono stati sottoposti a CMS per 5 settimane. Attraverso il test di preferenza per il saccarosio siamo riusciti a distinguere i ratti resilienti (CMS-R) da quelli vulnerabili (CMS-V) allo stress. KET (10 mg/kg), somministrata in acuto ai CMS-V 24 ore prima del sacrificio, è stata in grado di invertire il comportamento anedonico. Il CMS ha indotto importanti cambiamenti fenotipici in tutti i ratti stressati, anche se la diminuzione nell’incremento ponderale, l'aumento dei livelli serici di corticosterone e l'aumento del peso delle ghiandole surrenali sono risultati più elevati nei CMS-V. Una riduzione del rilascio di glutammato, sia basale, che evocato da depolarizzazione, è stata osservata selettivamente in sinaptosomi in superfusione da HPC di CMS-V e nei sinaptosomi da PFC/FC di CMS-R. KET è stata in grado di ripristinare il rilascio di glutammato basale, ma non quello depolarizzato, nei CMS-V. Mediante Western Blot, sono state misurate alterazioni area e frazione cellulare specifiche nei livelli di espressione e di fosforilazione di determinate proteine coinvolte nel rilascio di glutammato e nella risposta dello stress, in omogenato totale, sinaptosomi e membrane sinaptiche da HPC e PFC/FC. Tramite qPCR abbiamo rivelato una significativa riduzione dei trascritti totali di BDNF e delle sue varianti di splicing in HPC e PFC/FC di tutti i ratti stressati, inclusi quelli trattati con KET. Tuttavia, studi di ibridazione in situ hanno riscontrato un ridotto traffico dendritico di mRNA totale di BDNF e BDNF-2/BDNF-6 in CA1 e CA3 di CMS-V, mentre il trattamento con KET, pur non ripristinando i cambiamenti nei livelli di mRNA totale di BDNF, è stato in grado di ristabilire il traffico dendritico in CA3 di CMS-V. L'analisi morfologica dei neuroni piramidali in CA3, in sezioni marcate con il metodo di Golgi-Cox, ha mostrato una riduzione della lunghezza totale e della ramificazione dei dendriti apicali, ma non di quelli basali. KET ha ripristinato tali modifiche ai livelli di controllo. Nel complesso, i nostri risultati mostrano che l'esposizione allo stress cronico induce alterazioni funzionali e morfologiche in HPC e PFC/FC di ratti vulnerabili. È interessante notare che una singola amministrazione di KET è in grado di recuperare la maggior parte di questi deficit.