USE OF NATURAL ADDITIVES AS FEED SUPPLEMENTS TO REDUCE THE METHANE EMISSION FROM RUMINANTS

A causa del divieto di utilizzo di antibiotici come additivi alimentari promotori della crescita, da parte dell'Unione Europea nel 2006, gli estratti vegetali e i relativi metaboliti secondari sono stati considerati come una valida alternativa per la manipolazione dell’ambiente ruminale. Il termine "metabolita secondario" viene utilizzato per descrivere una vasta gamma di composti chimici vegetali che non sono coinvolti nei processi biochimici di crescita e riproduzione vegetali, ampiamente studiati ed utilizzati in medicina e nella conservazione degli alimenti. La tecnologia disponibili per misurare l'emissione di metano in vivo è molto costosa, lenta, laboriosa e non applicabile su vasta scala. Per questo motivo sono state condotte numerose ricerche usando tecniche di simulazione in vitro, che consentono di stimare l'emissione in vivo. Tuttavia i sistemi in vitro sono spesso criticati a causa della breve durata (24 ore, per esempio) e della mancanza di adattamento dell’ambiente ruminale al composto in esame. Sulla base di questi argomenti, i contributi della presente tesi hanno l’obiettivo di studiare le fermentazioni ruminali e l'emissione di metano aplicanto differente metodologicie sperimentali e differenti principi attivimetodologie per, come di seguito sintetizzato: 1) Screening di additivi naturali utilizzando un sistema batch culture; 2) Verificare, attraverso un sistema batch culture, l'effetto della somministrazione in vivo di alcuni additivi naturali allo scopo di adattare il liquido ruminale utilizzato come inoculo; 3) Misura l'effetto di un estratto naturale utilizzando un sistema continuo a lungo termine; 4) Studiare le conseguenze sui prodotti lattiero-caseari della somministrazione di additivi naturali a vacche da latte. Nel primo contributo si è voluto esaminare gli effetti di quattro estratti vegetali puri (sulfuro di allile, cinnamaldeide, eugenolo e limonene) ed un composto sintetico (monensin), sulle fermentazioni ruminali e la produzione di metano enterico di una dieta standard per vacche da latte. Il sistema utilizzato (batch culture) è dotato di valvole per il rilascio automatica del gas di fermentazione a pressione fissa ed è equipaggiato con un sistema wireless di trasmissione in continuo dei dati misurati. I dosaggi testati sono stati 2: 3 e 30 mg/g di dieta incubata, per ogni estratti vegetali, e 0.015 o 0.030 mg/g di dieta nel caso del Monensin. I risultati della prova hanno evidenziato una generale inefficacia di tutti gli estratti a basso dosaggio. Tuttavia l'elevato dosaggio del limonene ha causato una marcata riduzione della degradabilità della fibra NDF (NDFd) (-68%) e della degradabilità della sostanza secca (TDMd) (-14%) rispetto al controllo. anche l'alto dosaggio di eugenolo (-15% e -4%, per NDFd e TDMd rispettivamente) e del monensin (-16% e -3% rispettivamente per NDFd e TDMd) hanno ridotto la degradabilità della dieta ma tali effetti sono stati più contenuti. Non sono emersi effetti significativi nel caso degli altri additivi su NDFd e TDMd, indipendentemente dal dosaggio. Rispetto al controllo, l'elevato dosaggio di sulfuro di allile, cinnamaldeide, eugenolo, limonene e monensin ha significativamente ridotto anche la produzione di gas (ml/g DM, -16%, -12%, -9 %, -38%, -12% rispettivamente) mentre la produzione di CH4 in vitro è stata significativamente ridotta solo da alti dosaggi di sulfuro di allile, cinnamaldeide, limonene e monensin (-32%, -12%, -43%, -18%, rispettivamente, confrontati con al controllo). Solo l'elevato dosaggio di sulfuro di allile e limonene riduce significativamente la percentuale di CH4 nei gas di fermentazione (-18% e -12%, rispettivamente, rispetto al controllo). I risultati più promettenti sono stati osservati per l'alto dosaggio di cinnamaldehide, che ha ridotto la produzione di CH4 in vitro senza compromettere la digeribilità della dieta e la produzione di acidi grassi volatili. Sulla base dei risultati del primo contributo stati selezionati tre additivi considerati più efficaci nella riduzione dell'emissione di metano, ma preservando la degradabilità della dieta e la funzionalità dell’ambiente ruminale: cinnamaldeide, limonene e sulfuro di allile. Nel secondo contributo gli additivi sono stati sottoposti a test in vitro (batch culture) in seguito ad una fase precedente di adattamento. L’obiettivo è stato di valutare l'effetto del liquido ruminante che non è stato adattato (NAF) e del liquido ruminale adattato (AF) alla presenza dell'estratto in vivo, prima di essere utilizzato come inocula microbico nel test in vitro. La prova ha previsto l’uso di quattro vacche in asciutta alimentate con dieta di riferimento per vacche da latte, addizionata dei composti puri, seguendo uno schema sperimentale a quadrato latino 4x4. I liquidi ruminali raccolti sono stati utilizzati come inoculo con o senza l'aggiunta dei 3 composti anche in sede di incubazione. Gli estratti sono stati testati per la cinetica di produzione di gas in vitro ed i prodotti di fermentazione. In generale, l’effetto dei diversi additivi sulle fermentazioni ruminali hanno confermato la prova di screeningprecedentemente realizzata. Per quanto riguarda l'adattamento in vivo del liquido ruminale, l'uso di AF non ha influenzato alcun parametro di fermentazione rispetto al NAF ma, aggiungendo il sulfuro di allile in sede di incubazione, la portata degli effetti di questo composto è stato maggiore quando incubato con AF rispetto a NAF. Questi risultati suggeriscono che la somministrazione di composti puri a vacche può influenzare l'attività della microflora ruminale e quindi la risposta di esperimenti condotti in vitro. Nel terzo contributo si è voluto categoria di metaboliti secondari, i flavonoidi, che sono stati recentemente oggetto di interesse per la loro vasta gamma di attività biologiche, ma anche per le loro proprietà antimicrobiche. è stato ipotizzato che un estratto di liquirizia, ricco di isoflavonoidi prenilati ed in particolare glabridina, potrebbe potenzialmente migliorare l'efficienza dell'utilizzo dell'azoto e diminuire la produzione di metano ruminale. L'esperimento è stato condotto utilizzando la tecnica di simulazione a lungo termine (RuSiTec), che consente di mantenere per lungo tempo la vitalità e la funzionalità del microbioma ruminale e adattare il liquido alla presenza dell'estratto, a differenza del sistema batch culture. L’estratto è stato testato in due dosaggi: 1 g/L e 2 g/L. I risultati ottenuti hanno evidenziato che la dose di 1 g/L ha ridotto la produzione di ammoniaca (-51%, P <0,001) senza influenzare il processo di fermentazione complessivo. Quando invece sono stati aggiunti 2 g/L, non solo la produzione di ammoniaca è diminuita (-77%; P <0.001), ma anche la produzione di metano (-27%, P = 0.039) e la produzione totale di VFA (-15%; P = 0.003). Questi effetti in fermentazione sono probabilmente correlati ad una diminuzioni del numero di protozoi e ad una modificazione nella struttura della comunità battericha e degli arcaea con riduzione della biodiversità. In conclusione quindi, l'inclusione di un estratto di liquirizia, ricco di isoflavonoidi nella dieta, può potenzialmente migliorare l'efficienza dell'utilizzo della dieta da parte dei ruminanti, sulla base degli effetti verificati in vitro. L’utilizzo di metaboliti secondari come additivi alimentari per vacche in produzione comporta necessariamente il possibile passaggio nel latte di sostanze che possono modificare la qualità dei prodotti lattiero-caseari. A questo proposito, la letteratura risulta molto limitata, e dal momento che non ci sono prove disponibili, l’obiettivo del quarto contributo è stato verificare come l'uso di aglio e sulfuro di allile, recentemente proposti come modulatori delle emissioni di metano enterico, influenzino i prodotti lattiero-caseari. L’effetto è stato verificato sull’ingestione di sostanza secca, le prestazioni produttive, le proprietà di coagulazione del latte, la resa casearia del formaggio, il profilo sensoriale di latte e formaggio e le caratteristiche reologiche di quest’ultimo. Quattro vacche in lattazione sono state alimentate con una dieta di riferimento senza la presenza di additivi (controllo) o integrata con 2 dosi crescenti di aglio, 100 o 400 g/d, o con 2 g/d di sulfuro di allile, in 4 periodi sperimentali consecutivi secondo uno schema a quadrato latino 4×4. Ogni periodo sperimentale era costituito da 7 d di transizione e 14 d di trattamento. Il latte è stato campionato per l'analisi chimica e la caseificazione. Le proprietà organolettiche del latte e dei formaggi, dopo stagionatura di 63 giorni, sono state valutate da un gruppo di 7 valutatori addestrati. I trattamenti sperimentali non hanno avuto effetti sull’ingestione alimentare, sulla produzione di latte, sull'efficienza alimentare, sulle proprietà coagulative del latte, sul recupero dei nutrienti e sulla resa casearia. L'aroma ed il sapore del latte e del formaggio sono stati particolarmente influenzati dai trattamenti sperimentali, in particolare dalla dose più alta di spicchi d'aglio. I risultati hanno evidenziato un’elevata correlazione tra latte e formaggio per quanto riguarda l'aroma di aglio (R2 = 0,87) ed il flavor di aglio (R2 = 0,79). Il sulfuro di allile e la dose più alta di spicchi d'aglio (400g/d) hanno provocato una riduzione del pH, dello sforzo di taglio ed il corrispondente lavoro di taglio dei formaggi stagionati. L’agli in spicchi ed il sulfuro di allile hanno mostrato effetti opposti sugli indici colorimetrici del formaggio stagionato. In conclusione, l’integrazione di 400 g/d di aglio in diete per vacche in lattazione influenza notevolmente le caratteristiche sensoriali e reologiche del formaggio.