Biochemical and spectroscopic analysis of two key proteins involved in FeS-clusters biogenesis

I gruppi di FeS sono gruppi protesici ancestrali, ampiamente diffusi in quasi tutti gli esseri viventi in cui sono coinvolti in diverse vie metaboliche fondamentali, tra cui reazioni redox, trasferimento di elettroni, catalisi enzimatica e molte altre funzioni. Questo assortimento si riflette nella presenza di numerosi cluster FeS con diverse strutture, dai semplici cluster rombici 2Fe2S e 4Fe4S cubici, al complesso cluster 2Fe [4Fe4S] H (cofattore metallico di [FeFe] -idrogenasi). Esistono percorsi biosintetici distinti per l'assemblaggio di diversi gruppi di FeS, sia nei microrganismi procarioti che negli eucarioti. In generale, questi sono processi piuttosto complessi realizzati da molte proteine ​​che interagiscono tra loro. Pur mantenendo alcune peculiarità chiave, questi sistemi sono altamente conservati in termini di strategia d'azione, che può essere generalmente suddivisa in due fasi principali: l'assemblaggio del cofattore metallico su una proteina scaffold e il successivo trasferimento del cluster FeS de novo generato da l'impalcatura dell'apoproteina dell'accettore, che alla fine viene convertita nell'oloproteina attiva matura. Entrambi i passaggi richiedono proteine ​​chiave dello scaffold, che devono essere in grado di interagire dinamicamente con i partner biosintetici e con una combinazione di diversi chaperon e co-chaperon che partecipano al trasferimento finale del gruppo protesico alla proteina FeS ricevente. Pertanto, le caratteristiche strutturali delle proteine ​​dello scaffold che consentono le loro interazioni con tutti i partner funzionali sono punti chiave. Tuttavia, per molte di queste proteine ​​fondamentali manca una chiara caratterizzazione delle relazioni struttura-funzione, e una caratterizzazione completa dell'intero complesso percorso molecolare multistep in cui sono coinvolte funzionalmente necessita di un'indagine più approfondita. In questa tesi di dottorato, sono stati studiati due diversi sistemi di biosintesi di cluster FeS: nel Capitolo 1, il sistema di maturazione [FeFe] -idrogenasi e nel Capitolo 2), il FeS mitocondriale umano raggruppa il sistema biosintetico. Capitolo 1) [FeFe] -idrogenasi sono proteine ​​FeS che in diversi procarioti e in alghe verdi unicellulari catalizzano la riduzione reversibile dei protoni al gas idrogeno. Pertanto, hanno ricevuto una crescente attenzione per le potenziali applicazioni tecnologiche nel campo della produzione biologica di carburante pulito e rinnovabile. È necessario un sistema biosintetico specifico e altamente conservato per assemblare il cluster FeS (FeFe) -idrogenasi complesso, il cosiddetto cluster H, composto da un centro 4Fe4S collegato a un subcluster 2Fe coordinato da CO e ligandi CN quanto a un ponte ditiolato. Nonostante l'elevata complessità di questo cofattore, la sua biosintesi e trasferimento sono effettuati da sole tre proteine ​​specifiche, che funzionano in combinazione con il meccanismo di biogenesi del cluster FeS: HydE e HydG assemblano l'H-cluster sulla proteina scaffold HydF, una piccola GTPase che guida anche la consegna del cluster completo alla apoidrogenasi bersaglio. Pertanto, HydF svolge un duplice ruolo centrale nello scaffold di cluster FeS e nella proteina carrier nella maturazione di [FeFe] -idrogenasi. Sebbene diversi dati molecolari e funzionali siano stati ottenuti dalla scoperta dei macchinari HydE / HydF / HydG, l'intero processo biosintetico non è ancora completamente caratterizzato. La struttura cristallina dell' apoproteina ricombinante HydF è stata risolta nel mio laboratorio e ha suggerito utili informazioni molecolari sulla funzione proteica. D'altra parte, sono rimasti alcune questioni aperte, incluso il ruolo specifico del dominio GTPasico di HydF, che è essenziale per la maturazione e l'attivazione di [FeFe] -idrogenasi. Capitolo 2). Nei mammiferi, i cluster di FeS sono principalmente presenti e sintetizzati nei mitocondri. Il loro assemblaggio viene eseguito da un sistema complesso e altamente conservato che coinvolge diverse proteine. Tra questi, l'ISCU è lo scaffold su cui sono sintetizzati i cluster FeS nel cosiddetto SDU, che include anche la desulfurase NFS1, la proteina accessoria ISD11 e la fratassina (FXN). FXN è una proteina legante il ferro (Fe2 + e Fe3 +) il cui ruolo specifico in questo percorso biosintetico è ancora controverso, in quanto è stato inizialmente proposto come donatore di ferro del processo e quindi attivatore allosterico del complesso SDU. Negli esseri umani, i difetti di ISCU o FXN portano a malattie con fenotipi clinici distinti ma caratteristiche cellulari e biochimiche simili. Diminuzione dei livelli di isoforme mitocondriale ISCU causata da una mutazione puntiforme del gene ISCU portano a una rara miopatia con acidosi lattica (miopatia ISCU); livelli diminuiti di FXN, a causa di un'anomala espansione della ripetizione del trinucleotide GAA nel gene FXN, causano l'atassia di Friedreich (FRDA), una malattia neurodegenerativa. Le caratteristiche cellulari di entrambe le malattie sono la respirazione compromessa, il sovraccarico di ferro mitocondriale e l'aumento della sensibilità allo stress ossidativo, e per entrambi una terapia specifica è ancora mancante. Ciò può essere dovuto, almeno in parte, a una caratterizzazione incompleta del / i percorso / i in cui sono coinvolte queste proteine, e in particolare vale la pena notare che FXN è una proteina che sta ancora cercando una funzione. Sulla base di queste premesse, ho focalizzato il lavoro del mio dottorato su questi due problemi aperti sfruttando, in entrambi i casi, una combinazione di approcci biochimici e spettroscopici per valutare le caratteristiche strutturali di 1) dominio GTPase di HydF e 2) FXN, entrambi soli e nel complesso binario con l'impalcatura ISCU. In particolare, per esplorare la proteina HydF e la sua risposta strutturale al legame GTP, in collaborazione con il Prof. Carbonera (Dipartimento di Scienze Chimiche di Padova, Università di Padova), ho sfruttato una tecnica spettroscopica avanzata, EPR (Electron Paramagnetic Resonance), cioè la tecnica definitiva per lo studio delle proteine ​​FeS; per caratterizzare in dettaglio l'interazione diretta FXN-ISCU, ho applicato la tecnica bidimensionale NMR (Nuclear Magnetic Resonance), in collaborazione con il Prof. Bellanda (Dipartimento di Scienze Chimiche, Università di Padova). Capitolo 1). Ho effettuato studi spettroscopici in vitro per caratterizzare il dominio GTPasico di HydF. I risultati ottenuti mi hanno permesso di concludere che HydF può essere considerato un nuovo membro delle GTPasi dipendenti da K +. Pertanto, queste proteine ​​potrebbero avere una più ampia diffusione di funzioni rispetto a quanto supposto prima. HydF potrebbe essere un interruttore molecolare sottoposto a significative modifiche strutturali sul legame GTP, come altri membri della stessa famiglia. Inoltre, sono stati rilevati cambiamenti conformazionali diffusi dovuti al legame GTP, e questo potrebbe essere cruciale per interazioni strutturali e funzionali dinamiche con le altre proteine ​​coinvolte nella maturazione e attivazione di [FeFe] -idrogenasi. A partire da questa scoperta, sarà possibile modellare lo stato di HydF legato a GTP, un'importante informazione strutturale che mancava nella struttura a raggi X dell'apoproteina precedentemente risolta nel nostro laboratorio. Capitolo 2). Ho eseguito analisi biochimiche e spettroscopiche di FXN umana, da solo e in complesso con ISCU, che mi ha permesso di identificare in FXN i residui coinvolti nel legame di Fe3 + / 2 + e nella sua interazione con ISCU, che è confermato essere dipendente dal ferro . Quindi, poiché molti residui di FXN che ho trovato coinvolti nell'interazione diretta con ISCU sono mutati in pazienti con varianti di FRDA, ho valutato se e come queste mutazioni possono interferire con l'interazione diretta ISCU-FXN e con la sua capacità di legare il ferro. Ho trovato che le varianti di fratassina FRDA-correlate in cui le mutazioni si trovano nella regione di legame ISCU non influenzano le proprietà di legame con ferro di fratassina, mentre compromettono sia l'interazione con ISCU e la capacità di attivare il complesso SDU. Altre varianti di fratassina legate a FRDA, invece, in cui le mutazioni sono localizzate nella regione di legame del ferro o tra quest'ultima e la regione legante ISCU, influenzano, come previsto, la capacità di FXN di legare il ferro senza compromettere completamente la sua interazione con ISCU. Inoltre, queste varianti FXN mantengono una capacità parziale di attivare il complesso SDU. Presi insieme, questi risultati aprono nuove prospettive nello studio dei meccanismi che portano alle varianti FRDA e forniscono ulteriori suggerimenti utili a chiarire il ruolo fisiologico di FXN e il suo contributo alla patogenesi dell'atassia di Friedreich.