Novel regenerative medicine approaches with the use of adult mesenchymal stem cells: in vitro and in vivo experimental procedures

Nell’ultima decade, le cellule staminali mesenchimali adulte (CSM) sono state considerate una cura innovativa per la medicina umana e veterinaria. Questo progetto di ricerca supporta l’efficacia delle cellule staminali nella rigenerazione dei tessuti muscolo-scheletrici e cutanei. In particolare è stata analizzata la loro potenzialità in vitro nel differenziare in tenociti e mioblasti e la loro capacità, in vivo, nel riparare danni alla cute. Le lesioni tendinee e muscolari sono frequenti e altamente debilitanti, possono originare da diversi eventi come traumi, lacerazioni, contusioni e malattie degenerative (distrofie muscolari). Attualmente una cura efficace non è ancora nota per cui risulta molto difficile riacquisire la restitutio ad integrum del tessuto lesionato. La prima parte di questa tesi di dottorato si è focalizzata sulla riprogrammazione in vitro di cellule stromali isolate da tessuti mesenchimali di cavalli e pecore verso la via tenogenica e miogenica usando nuove metodologie di trasfezione senza l’uso di vettori virali. 1) CSM isolate da sangue periferico di cavallo sono state indotte a differenziare verso la via tenogenica in presenza di quattro fattori di crescita come il TGFβ3 (fattore di crescita trasformante-3), EGF2 (fattore di crescita dell’epidermide-2), bFGF2 (fattore di crescita dei fibroblasti-2) e IGF-1 (fattore di crescita insulino-1) combinati tra loro in presenza o in assenza della Tecnologia Low Level Laser (LLLT). 2) CSM isolate da sangue periferico di cavallo sono state indotte a differenziare verso la via miogenica usando il complesso TAT-MyoD in presenza di un terreno di crescita condizionato ottenuto dalla co-coltura tra CSM e le cellule C2C12 senza il loro diretto contatto. 3) Nanoparticelle di maghemite (SAMNs) sono state testate come vettori di trasfezione in CSM isolate da sangue periferico di cavallo senza l’impiego di campi magnetici esterni. La caratterizzazione di queste tre tecniche è stata effettuata usando analisi molecolari ed immunoistochimiche. Per individuare la miglior combinazione di fattori di crescita nel differenziamento verso la linea tenogenica, in presenza o assenza della tecnologia LLLT, sono state effettuate real-time PCR (rt-PCR) analizzando i livelli di espressione genica dei markers tenogenici Early Growth Response Protein-1 (EGR1), Tenascina C (TNC) e Decorina (DCN). Per valutare il differenziamento delle CSM verso la miogenesi, sono state effettuate analisi con rt-PCR valutando l’espressione genica di Myf5 e Miogenina, mentre saggi di immunofluorescenza sono stati eseguiti per stimare l’espressione delle proteine MyoD, Myf5 e Miogenina nelle cellule staminali mesenchimali adulte. Infine, saggi di immunofluorescenza sono stati effettuati per valutare l’efficienza di trasfezione delle SAMNs mentre gli effetti citotossici delle nanoparticelle sono stati osservati con il saggio di proliferazione cellulare XTT. La seconda sezione di questa tesi di dottorato si è focalizzata sulla rigenerazione della cute in vivo. La cute è un organo che ricopre l’intera superficie del corpo e possiede la capacità di auto-riparazione e di auto-rinnovo formando un’importante barriera tra l’ambiente esterno ed interno. Danni alla pelle possono creare ferite debilitanti che intaccano la struttura anatomica e la funzione della cute stessa. Nei due lavori presenti nella seconda parte di questa tesi, è stata studiata la capacità delle CSM isolate da sangue periferico di cavallo e di pecora di rigenerare lesioni cutanee sperimentali. 1) Lesioni cutanee sono state indotte in corrispondenza dei muscoli dei glutei di sei cavalli e trattate con CSM epiteliali autologhe (Ep-MSCs), allogeniche, soluzione salina o non trattate. 2) CSM allogeniche isolate da sangue periferico di pecora sono state utilizzate per trattare lesioni effettuate sul dorso di sei pecore. Questo progetto rientra in uno studio molto più ampio dove trattamenti convenzionali come Miele di Manuka, Connettivina e Acemannano, sono stati comparati a trattamenti innovativi come le CSM e il gas ionizzato plasma. In questa tesi di dottorato, è stato riportato solo l’articolo inerente la rigenerazione della cute utilizzando CSM allogeniche. Il primo lavoro di questa sezione riporta i risultati ottenuti con analisi molecolari (rt-PCR) su tessuto cutaneo bioptico equino dopo una e cinque settimane di trattamento con Ep-MSCs. I livelli di espressione dei geni Interferone-y (IFN-y), Interleuchina-6 (IL-6), fattore di crescita dell’endotelio vascolare (VEGF), fattore di crescita dell’epidermide-2 (EGF2), fattore di crescita insulino-1 (IGF-1) e cheratina dell’epidermide (eKER) sono stati studiati per analizzare la risposta immunitaria, la neo vascolarizzazione e la cheratinizzazione epidermica. Nel secondo lavoro, sono state effettuate analisi cliniche per analizzare il tempo di guarigione, la presenza, il colore e la natura dell’essudato, l’aspetto della garza, l’idratazione della ferita, la percentuale di ri-epitelizzaione e di contrazione delle lesioni. Il tessuto bioptico prelevato dopo 15 e 42 giorni di trattamento è stato utilizzato per analisi molecolari, istologiche ed immunoistochimiche. Mediante le analisi molecolari sono stati valutati i livelli di espressione dei geni Collagene 1α1 (Col1α1) e cheratina del pelo (hKER). L’infiammazione dermica e sottocutanea, il tessuto di granulazione immaturo e maturo e gli annessi cutanei sono stati valutati mediante analisi istologiche mentre il complesso maggiore di istocompatibilità (MHCII), il fattore di von Willebrand e il marker di proliferazione cellulare KI67 sono stati studiati con saggi di immunoistochimica.