Leucemie linfoblastiche acute T pediatriche: Analisi di mutazione attraverso il sequenziamento di ampliconi o dell'intero esoma

Presupposti. La leucemia linfoblastica acuta (ALL) E' la più frequente patologia neoplastica dell'età  pediatrica ed è generalmente caratterizzata da una buona prognosi, con un tasso di guarigione a lungo termine di circa il 90%. La stratificazione dei pazienti in gruppi di rischio, basata su caratteristiche cliniche e risposta al trattamento, permette di sottoporre a terapia intensiva i pazienti ad alto rischio di recidiva migliorandone l'outcome, prevenendo nel contempo l'esposizione dei pazienti a basso rischio a eccessiva tossicità. L'attivazione di NOTCH1 e l'inattivazione di PTEN sono eventi frequentemente implicati nella leucemogenesi della T-ALL, così da configurarsi come possibili elementi chiave per una stratificazione del rischio su base non solo clinica, ma anche genetica. NOTCH1 è coinvolto nella regolazione trascrizionale di IL7R, gene noto mutato in circa il 10% dei casi di T-ALL. In aggiunta, il NOTCH1 signaling è coinvolto anche nella regolazione dell'espressione della ciclina D3. Questa proteina implicata nella proliferazione cellulare, è necessaria per lo sviluppo della T-ALL. Infine, studi recenti identificano nuove alterazioni genetiche associate alla prognosi e che possono quindi essere utilizzate per la stratificazione dei pazienti, nonchè per una terapia mirata. In questo contesto, risulta interessante l'identificazione di nuove mutazioni che potrebbero avere un ruolo nella leucemogenesi. Scopo dello studio. Lo scopo principale di questo studio è la definizione del potere prognostico delle alterazioni dei geni NOTCH1 e PTEN nella T-ALL pediatrica. A questo fine, è stato analizzato, in una grande coorte di pazienti trattati secondo il protocollo AIEOP ALL2000/R2006 e AIEOP ALL2009, il profilo mutazionale di NOTCH1 e PTEN, correlandolo poi con l'incidenza di ricaduta e la sopravvivenza libera da eventi. Il secondo obiettivo oggetto di studio è l'utilizzo delle mutazioni somatiche come marcatore genetico specifico della cellula tumorale utilizzando le tecniche di sequenziamento di nuova generazione per identificare la presenza di cellule residue nel midollo osseo durante la terapia. A tale scopo, è stato analizzato lo stato mutazionale di IL7R alla diagnosi e al giorno +33 di terapia, in un ampia coorte di pazienti che seguono il protocollo AIEOP ALL2000/R2006, confrontandola con l'analisi in RQ-PCR della MRD agli stessi time point. Infine, per identificare nuovi geni implicati nella patogenesi della leucemia, nel lavoro è stata analizzata la ricorrenza di mutazione di CCND3. Materiali e metodi. Campioni di midollo osseo, ottenuti al momento della diagnosi da 272 pazienti affetti da T-ALL, sono stati analizzati con Sanger sequencing allo scopo di identificare le mutazioni di PTEN. Mutazioni attivanti di NOTCH1 sono state invece ricercate con Sanger sequencing degli esoni codificanti per i domini HD, PEST e TAD. Mutazioni attivanti IL7R sono state analizzate mediante Sanger sequencing e deep-amplicon sequencing in 227 pazienti T-ALL. L'esoma della diagnosi T-ALL e del relativo controllo di 8 pazienti alto rischio è stato analizzato mediante Ion Torrent Technology. Infine, le mutazioni di CCND3 sono state ricercate mediante Sanger sequencing alla diagnosi di 80 pazienti T-ALL. Risultati. La prevalenza delle mutazioni di PTEN e NOTCH1 è risultata rispettivamente pari a 12% e 65%. L'analisi della sopravvivenza mostra una più alta incidenza di ricaduta ed una sopravvivenza inferiore nei pazienti con mutazioni inattivanti PTEN. Al contrario, l'analisi della sopravvivenza basata sulla presenza della mutazione in NOTCH1 mostra un significato prognostico positivo in event free survival (EFS) nella corte AIEOP T-ALL totale, ma lo stesso risultato non si osserva nei pazienti trattati con l'ultimo protocollo terapeutico analizzato AIEOP ALL2009. Poichè l'unica differenza evidenziabile tra questa coorte e quelle descritte in letteratura consta nella tipologia di trattamento, si ipotizza che l'impatto prognostico di PTEN e NOTCH1 dipenda dal protocollo terapeutico utilizzato. Mediante deep-sequencing sono state identificare le mutazioni clonali di IL7R con grande sensibilità anche quando la frequenza di mutazione è inferiore al 10%. Infine, mediante Ion Proton System technology è stata identificata una mutazione missenso nel gene CCND3 con una ricorrenza, verificata in Sanger sequencing, del 6% all'interno di una più ampia coorte di T-ALL. Conclusioni. Nella coorte di pazienti analizzata, la presenza della mutazione in PTEN incide sull'outcome e lo screening per le alterazioni di questo soppressore tumorale sembra pertanto utile per la stratificazione dei pazienti in gruppi di rischio alto. Al contrario, la correlazione della mutazione in NOTCH1 con l'outcome sembra dipendere dal tipo di trattamento terapeutico utilizzato e lo screening per le alterazioni di questo pathway non sembra pertanto utile per la stratificazione dei pazienti in gruppi di rischio. Futuri modelli di stratificazione dovranno comunque includere un maggior numero di marker genetici. Dall'interpretazione preliminare dei dati di IL7R ottenuti mediante deep amplicon sequencing è possibile affermare che la metodica consente di identificare la singola cellula tumorale anche a livello subclonale e di seguirne il decorso durante la terapia. Infine, l'identificazione di mutazioni somatiche a carico del gene CCND3 e la verificata espressione a livello dei blasti dell'esordio dei pazienti T-ALL fa supporre che queste alterazioni genetiche siano funzionali e contribuenti alla patologia. Questi risultati e i successivi studi funzionali che saranno effettuati per valutare l'eventuale gain-of-function della proteina mutata nei blasti leucemici, potranno fornire un nuovo target terapeutico di supporto agli attuali trattamenti utilizzati per la cura di questa malattia.