Single organelle fret-based analysis of intracellular calcium: different effects of presinilis carrying Familial Alzheimer's Disease mutations

Il Calcio (Ca2+) è uno dei principali messaggeri intracellulari coinvolto quasi in tutti gli aspetti della vita cellulare. In particolare, il Ca2+ gioca un ruolo essenziale nello sviluppo neuronale, plasticità e trasmissione sinaptica, come anche nella regolazione delle vie metaboliche e dell’apoptosi. Il primo obbiettivo del mio lavoro è stato studiare in dettaglio l’apparato di Golgi (AG) come riserva intracellulare di Ca2+. Il complesso del Golgi può contenere più del 5% della totalità del Ca2+ cellulare a concentrazioni significativamente maggiori che in altre regioni cellulari. L’apparato del Golgi contiene tipicamente anche una moltitudine di proteine leganti Ca2+ e canali per il Ca2+. L’uso di una sonda cameleon specificamente indirizzata al trans-Golgi, ci ha permesso di dimostrare direttamente l'eterogeneità funzionale dell’AG mettendo in luce le caratteristiche distinte di questo subcompartimento : l’accumulo di Ca2+ avviene esclusivamente tramite SPCA1 (e non tramite SERCA); inoltre, in risposta a generazione di IP3 non c’è rilascio di Ca2+, ma un suo piccolo accumulo come conseguenza dell’aumento di Ca2+ citosolico. Usando una nuova sonda per il Ca2+ basata sulle GFP selettivamente indirizzata nel cis/medial-Golgi, (mGo-D1cpv), abbiamo dimostrato che il medial-Golgi si comporta in una maniera unica, rilasciandolo Ca2+ dopo stimolazione non solo di agonisti liberanti IP3, ma anche attraverso il recettore rianodinico (RyR) e basandosi, per l’accumulo di Ca2+, sia sulla SERCA che su SPCA1. In conclusione, l’AG rappresenta uno store intracellulare di Ca2+ con un alto grado di complessità . In uno spazio di pochi micron e nonostante il suo continuo intermescolamento dei vari subcompartimenti, il set di proteine che regolano l’omeostasi Ca2+ cambia in maniera consistente, separando sub-regioni funzionali, con differenti proteine regolanti il Ca2+, contribuendo alla sua omeostasi. Il secondo obbiettivo del mio lavoro è stato studiare in dettaglio, utilizzando sonde cameleon specificamente indirizzate, l’effetto di mutazioni familiari del morbo di Alzheimer (FAD) nei geni delle preseniline (PSs) 1 e 2. Nel nostro laboratorio è stato recentemente visto che la mutazione FAD PS2 riduce il contenuto di Ca2+ del principale store cellulare: il reticolo endoplasmatico (RE), principalmente inibendo l'attività della SERCA, come dimostrato a livello di popolazione cellulare utilizzando la sonda Ca2+ equorina indirizzata al RE. Per studiare l’effetto dell’espressione delle mutazioni FAD sull’omeostasi del Ca2+ nel RE in esperimenti FRET su singola cellula, abbiamo creato la nuova sonda cameleon indirizzata al RE (ERD4) con ottimizzate affinità al Ca2+ e range dinamico. L’omeostasi del Ca2+ nei diversi subcompartimenti, a livello di singola cellula, sono stati studiati nella linea cellulare SH-SY5Y sovra-esprimendo PS2 wild type (wt), PS2-T122R, PS1 wt opppure PS1-A246E, e anche in fibroblasti umani da pazienti FAD-PS2-N141I e FAD-PS1-A246E (con i rispettivi fibroblasti di controllo da controlli sani della stessa età e sesso). La concentrazione di Ca2+ ([Ca2+]) di RE e medial-Golgi, in cellule a riposo, è fortemente ridotta dalle PS2 mutate o wt (quest’ultima solo in sovra-espressione), ma non dalla PS1 mutata. Nel trans-Golgi, invece, la [Ca2+] in cellule a riposo risulta non essere alterata in nessun caso. Inoltre, il tasso di accumulo di Ca2+ in questi stores viene ridotto dalle PS2 mutate o wt (quest’ultima solo in sovra-espressione) e, solo nel medial-Golgi, il tasso di fuoriuscita del Ca2+ è potenziata. Questi risultati rafforzano la nostra ipotesi di un effetto inibitorio da parte della PS2 mutata sull'attività della SERCA. Tali risultati sono anche consistenti con il fatto che, all’interno del Golgi, solo il compartimento cis/medial ha il recettore IP3 e la pompa SERCA, mentre il trans-Golgi è mancante di entrambi. In conclusione, i nostri dati fanno luce sull'eterogeneità molecolare di diversi store intracellulari per il Ca2+ (e in distinti subcompartimenti dello stesso organello) e aggiungono nuovi dettagli per comprendere i meccanismi attraverso cui le PSs influenzano l’omeostasi del Ca2+ e la patogenesi delle FAD. In prospettiva futura, queste sonde cameleon saranno utilizzate per studiare alterazioni sull’omeostasi del Ca2+ indotte da mutazioni FAD-PS2 e, eventualmente, in vivo utilizzando vettori virali.