Sviluppo di scaffolds biologici da omento e muscolo scheletrico mediante processi di decellularizzazione

RIASSUNTO PRESUPPOSTI DELLO STUDIO La disponibilità di organi e tessuti ottenuti in laboratorio da materiale biologico è, ad oggi, una delle maggiori richieste nei casi di perdita di sostanza a causa di difetti congeniti o post-traumatici. A fronte di ciò, si è cercato di realizzare dei tessuti bioingegnerizzati mediante l’applicazione di processi di decellularizzazione e successiva ricellularizzazione. SCOPO DELLO STUDIO Gli obiettivi del presente lavoro sono stati i seguenti: • Sviluppare un nuovo tipo di scaffold biologico derivato dall'omento che conservi l’integrità strutturale della matrice extracellulare e della rete vascolare del tessuto nativo anche dopo una fase di decellularizzazione. • Sviluppare un ulteriore scaffold biologico da muscolo scheletrico, derivato dalla decellularizzazione del muscolo retto del coniglio, per la ricostruzione di un difetto della parete addominale. MATERIALI E METODI Per quanto riguarda la prima parte sperimentale, campioni di omento, di ratto e di uomo, sono stati decellularizzati mediante l'impiego di una serie di reazioni fisiche (congelamento/scongelamento ed agitazione meccanica), chimiche (EDTA e isopropanolo) ed enzimatiche (tripsina, endonucleasi e lipasi) che comportano la rimozione delle cellule e della loro componente lipidica. I campioni sono stati analizzati nelle varie fasi mediante colorazioni istologiche (ematossilina ed eosina, azan Mallory, van Gieson, PAS, Sudan, Oil Red), reazioni immunoistochimiche (anti-CD31, -CD34, -α actina del muscolo liscio) e colorazione con DAPI. Inoltre, sono state effettuate valutazioni quantitative allo spettrofotometro della concentrazione di DNA genomico al termine della decellularizzazione. Sono stati effettuati tentativi di ricellularizzazione dello scaffold mediante cellule della frazione stromale vascolare (SVF), isolate da campioni di lipoaspirato umano. È stato altresì sviluppato un ulteriore scaffold mediante decellularizzazione di campioni del muscolo retto di coniglio. Questi sono stati sottoposti a reazioni fisiche (congelamento/scongelamento), chimiche (EDTA e Triton X-100) ed enzimatiche (DNasi) ed i risultati sono stati analizzati mediante colorazioni istologiche (ematossilina ed eosina, azan Mallory, van Gieson). In seguito, lo scaffold è stato impiantato a tutto spessore in un coniglio ricevente in corrispondenza di un difetto della parete addominale con perdita di sostanza prodotto chirurgicamente. Dopo tre settimane, l’impianto è stato studiato mediante esame ecografico in vivo e, dopo sacrificio dell’animale, è stato analizzato mediante le colorazioni istologiche di cui sopra. RISULTATI Le colorazioni istologiche hanno confermato l'efficacia del procedimento di decellularizzazione con la perdita totale della componente lipidica propria dell'omento. Ciò ha portato alla realizzazione di uno scaffold acellulare nel quale è stata mantenuta l’organizzazione tridimensionale delle fibre collagene, elastiche e reticolari. Inoltre è stata evidenziata la preservazione della rete di canali vascolari. Studi preliminari hanno dimostrato, inoltre, la possibilità di ricellularizzare lo scaffold mediante introduzione di cellule appartenente alla SVF. Riguardo la seconda parte del progetto, è stato dimostrato che lo scaffold di derivazione muscolare ha mantenuto l'integrità della matrice extracellulare e della struttura dei canali vascolari, di cui rimangono apprezzabili i diversi strati che li compongono. A seguito dell’impianto nel coniglio ricevente è stata evidenziata, mediante ecografia in vivo, l’integrazione dello scaffold con i tessuti adiacenti con buone proprietà meccaniche. Dopo il sacrificio dell’animale l’analisi istologica dello scaffold ha delineato la presenza di tessuto riparativo e di nuovi canali vascolari nella sede del difetto addominale. Obiettivo futuro sarà quello di ricellularizzare lo scaffold con cellule progenitrici muscolari per favorire la rigenerazione in senso muscolare dello scaffold stesso. CONCLUSIONI Abbiamo ottenuto un nuovo tipo di struttura acellulare biologica derivante dall'omento, mediante l'applicazione del processo di decellularizzazione, il quale permette di minimizzare il più possibile le alterazioni della matrice extracellulare durante la rimozione delle cellule. In via preliminare lo scaffold è stato ricellularizzato con cellule appartenenti alla frazione stromale vascolare ma ulteriori esperimenti si focalizzeranno sul potenziamento della ricellularizzazione in vitro e su impianto in vivo. La decellularizzazione del tessuto muscolare ed il suo impianto in vivo ha permesso di identificare una struttura biologica in grado di offrire una valida alternativa ai materiali attualmente impiegati per la riparazione dei difetti di parete addominale. Anche in questa direzione verrà valutata in futuro la possibilità di ricellularizzare lo scaffold con cellule progenitrici.