Human corneal endothelial cell culture and corneal transplantation

La cornea è quel tessuto trasparente che riveste la superficie anteriore dell'occhio, e che consente di avere una visione ottimale e chiara. La trasparenza di questo tessuto è fondamentale e non può essere compromessa. La cornea umana è costituita da più strati,tra cui lo strato posteriore o “endotelio” è responsabile della trasparenza della cornea. L’ endotelio è un monostrato di cellule che permettono agli ioni ed ai soluti di essere trasportati dall’ umor acqueo alla cornea e viceversa, e che a sua volta mantiene la trasparenza della cornea conservando l'omeostasi tra la cornea anteriore e posteriore. L’endotelio non possiede capacità rigenerative. Attualmente, l'unico metodo di trattamento è la sostituzione dell'endotelio danneggiato con l'endotelio di un donatore sano. La cheratoplastica perforante, che prevede trapianti di cornea a tutto spessore,rappresentava l'unica soluzione terapeuticafino ad un decennio fa. Tuttavia, con i nuovi progressi nel campo dei trapianti di cornea, sono state identificate specifiche tecniche chirurgiche, come DMEK e DSAEK, che sostituiscono solo una parte (o uno strato) della cornea. Sono I risultati ottenuti, in termini di riabilitazione visiva, si sono rivelati vantaggiosi grazie all’utilizzo di queste procedure chirurgiche specifiche. Tuttavia, la DMEK è più impegnativarispetto alla DSAEK in quanto non è ancora completamente standardizzata. La DMEK ha diversi vantaggi in termini di tasso di riabilitazione e risultati visivi post-operatori e quindi è necessario standardizzare questa tecnica per una maggiore diffusione di tali interventi e anche considerando che questo è l'unico trattamento possibile per la cura di pazienti affetti da disfunzioni endoteliali. Sebbene il trapianto di cornea sia in fase avanzata, a causa di una quantità limitata di cornee da donatori ai fini di trapianto, approcci alternativi come la coltura di endotelio corneale in vitro svolgono un ruolo importante. La coltura di endotelio non è l'unico problema nel trapianto di endotelio (EK)dal momento che trapiantare un innesto di 20 micron di spessore all'interno dell'occhio destinatario rappresenta una sfida ulteriore. Inoltre, la disponibilità dei donatori per la coltura di endotelio corneale è inferiore, rendendo questa strategia ulteriormente più complicata. La tesi è quindi strutturata in modo da mettere in evidenza due questioni molto importanti nell’ attuale scenario della cheratoplastica endoteliale, 1) trapianto di cornea posteriore o EK, che è l'attuale metodo di trattamento per la cheratoplastica endoteliale e 2) coltura delle cellule endoteliali della cornea umana, che rappresenta il futuro della cheratoplastica endoteliale. Il Capitolo 1 è un'introduzione sul mondo dell’ Eye Banking, sulle sue caratteristiche attuali, sullo sviluppo nel mondo moderno e sul supporto per i chirurghi, non solo in termini di nuove tecniche, ma anche di dispositivi per interventi selettivi. Si evidenzia anche la conservazione dei tessuti corneali, che è un elemento importante nel campo dell’Eye Banking. Le banche degli occhi svolgono un ruolo significativo nel settore dei trapianti di cornea, dal momento cheraccolgono le cornee umane e le analizzano per ilsuccessivo trapianto. Le cornee non idonee per il trapianto possono essere utilizzate per la ricerca e quindi lo sviluppo dell’Eye Bankinge la ricerca possono influenzare il campo del trapianto di cornea. Il Capitolo 2 introduce l’argomento delle colture cellulari corneali e le tecniche attuali che sono utilizzate per la coltura ed il trapianto di cellule coltivate. Per capire il motivo e l'esigenza dell’ingegnerizzazione dei tessuti, è importante studiare la cornea umana, la sua matrice extracellulare ed il suo comportamento in diversi mezzi di coltura. Il comportamento biomeccanico di un tessuto sottile (DM) in condizioni diverse rappresenta una parte rilevante di questo studio per la futura ingegnerizzazione,che viene descritta nel Capitolo 3. E’ inoltre importante standardizzare il trattamento attualmente disponibile allo scopo di ridurre in futuro l’onere di pazienti con endotelio compromesso ed evitare danni o sprechi di tessuto, che attualmente avvengono nelle sale chirurgiche, fornendo tessuti standardizzati in terreni di conservazione validati, come descritto nel Capitolo 4. La DMEK è considerata il futuro della cheratoplastica endoteliale, dal momento che presenta vantaggi quali la velocità dei tempi di riabilitazione ed i risultati visivi. Il Capitolo 5 mette in evidenza l'importanza della nuova tecnica che consiste nell’arrotolare il tessuto DMEK per consentire un facile inserimento per poi dispiegarlo nell'occhio ricevente, rispetto alla tecnica attualmente utilizzata con endotelio arrotolato in senso opposto. Attualmente, i tessuti DMEK sono o preparati in sala operatoria o allestiti in Banca degli Occhi e spediti ai chirurghi. Tuttavia, non vi è alcuna procedura standardizzata che possa contribuire ad ottenereun lembo endoteliale validato prima dell'intervento e fornire un innesto ready-to-use ai chirurghi. Il Capitolo 6 descrive una nuova tecnica di pre-caricamento di un lembo endoteliale in una cartuccia IOL disponibile in commercio che può essere utilizzato come dispositivo di conservazione, trasporto e trapianto. Questa tecnica consentirà di ridurre ulteriormente gli sprechi nei trapianti e fornirà ai chirurghi un innesto pre-convalidato,riducendo ulteriormente il tempo complessivo in sala operatoria edi relativi costi. Quindi nella prima fase della tesi, sono stati analizzati i diversi approcci per standardizzare la tecnica DMEK. Le HCECs sono attualmente coltivate usando cornee di donatori giovani. Ci sono due aspetti importanti, in primo luogo la disponibilità di tessuti di donatori giovani è minore rispetto a quella di donatori anziani, ed in secondo luogo non vi è, ad oggi, alcun metodo standardizzato di coltura delle HCECs. Pertanto, per ridurre la domanda di tessuti a livello mondiale, vi è una forte necessità di coltivare leHCECsderivanti da cornee di donatori anziani, che sono meno proliferative e meno resistenti in natura, ma per le quali vi è una elevata disponibilità della fonte donatrice. Il Capitolo 7 descrivelo studio sull'isolamento delle HCECs e la successiva coltura di tali cellule ottenute da cornee di donatori anziani. Una volta stabilito il protocollo, è stato eseguito uno studio completocon un alto campionamento, per dimostrare la coerenza di questa tecnica,come evidenziato nel Capitolo 8. Nel frattempo si è anche osservato che le cellule da donatori anziani possono essere coltivate utilizzando l’inibitore ROCK in combinazione con acido ialuronico (HA). HA induce una forza meccanica alle cellule per far sì che siano saldamente attaccate alla base e consentire così una maggiore proliferazione,come descritto nel Capitolo 9. La seconda parte della tesi indaga quindi la tecnica di coltura delle HCECs da cornee di donatori anziani. Tuttavia, una volta che le cellule sono coltivate, un'altra sfida è trapiantarle nella camera anteriore dell'occhio. Ciò può essere eseguito utilizzando due strategie: la prima è quella di ad impiantare le cellule in forma di sospensione nella camera anteriore, tecnica che è già stata proposta, ma che non ha ancora fornito un’evidenza clinica; la secondaè quella di sviluppare un substrato per il trasporto delle cellule coltivate. Nel Capitolo 10, si identifica la colla di pesce (FSS)come una grande fonte di collagene e quindi come un potenziale scaffold da utilizzare per la cultura HCECs e successivo trapianto. E’ inoltre importante capire le norme che regolano gli studi scientifici ed il loro uso nelle applicazioni cliniche. Pertanto, nel Capitolo 11, viene descritta l’identificazione dell’ rHSA come sostitutodell’ FCS per la conservazione di cornee umane. Questo contribuirà anche a creare un terreno di coltura sintetico che potrebbe essere utilizzato per la cultura HCECs in condizioni GMP in futuro. In conclusione, si è osservato che il pre-caricamento di tessuti con endotelio rivolto verso l'interno e conservati in un terreno con destrano, potrebbe rappresentare una possibile soluzione per fornire un lembo per DMEK validato e standardizzato per il trattamento delle disfunzioni endoteliali. Le banche degli occhi svolgono un ruolo importante nello sviluppo di queste tecniche chirurgiche e relativi dispositivi, che potranno cambiarele modalità del trapianto di cornea in futuro. Una tecnica alternativa come la coltura di HCECs ha in sèil potenziale per il trattamento di disturbi endoteliali e substrati come FSS potrebbero essere utilizzati per la coltura edil trapianto di queste cellule. Tuttavia, l'efficacia di queste cellule potrà essere validata solo dopo uno studio clinico. Considerando le questioni regolatorie, il terreno sintetico potrebbe aiutare le banche degli occhi sia per la conservazione delle cornee e dei i nuovi prodotti come DMEK pre-caricati sia, in futuro, per le colture.