INCREASED SURVIVAL OF CLL B CELLS IN THE PRESENCE OF MARROW MESENCHYMAL STROMAL CELLS: A NOVEL MODEL TO DEFINE NEW TARGETS FOR THERAPY

La Leucemia Linfatica Cronica (LLC) è considerate la più comune leucemia del mondo occidentale, rappresentando circa il 30% delle leucemie dell’adulto, ed è caratterizzata dalla proliferazione clonale e dall’accumulo nel sangue periferico, nel midollo osseo e negli organi linfatici secondari di linfociti B maturi CD19+/CD5+/CD23+. Nonostante i linfociti B leucemici mostrino un’aumentata sopravvivenza nei pazienti affetti da LLC, in vitro vanno rapidamente incontro ad apoptosi. Il vantaggio sulla sopravvivenza è legato sia a difetti intrinseci del meccanismo di apoptosi sia a segnali forniti da cellule accessorie, presenti nel sito attivo della malattia. Precedenti studi hanno dimostrato che le cellule mesenchimali stromali (MSC) e le cellule accessorie (“nurse-like”) derivate rispettivamente dal midollo osseo e dal sangue periferico, sono coinvolte nell’aumentata longevità e mobilità del clone leucemico, suggerendo un ruolo cruciale delle MSC nel favorire la progressione della malattia. In questa tesi abbiamo valutato l’effetto delle MSC, la principale popolazione stromale nel midollo osseo dei pazienti affetti da LLC, sulla sopravvivenza dei linfociti B neoplastici e il loro ruolo sulla resistenza ai farmaci. Le MSC sono state isolate da campioni di sangue midollare provenienti da 46 pazienti affetti da LLC; la loro caratterizzazione immunofenotipica è stata effettuata sulla base dell’espressione di CD105, CD73 e CD90 e sulla negatività di CD14, CD34, CD45 e CD31. Allestendo co-colture di MSC e linfociti B leucemici, abbiamo confermato la capacità delle MSC di incrementare la sopravvivenza delle cellule B neoplastiche, fornendo un sistema di coltura in vitro che mima profondamente il microambiente della LLC in vivo. Abbiamo osservato una grande varietà sulla vitalità dimostrata dai diversi cloni leucemici e, mediante la valutazione del frammento clivato della proteina PARP, abbiamo identificato due differenti gruppi di cloni di LLC, con una diversa sensibilità ai segnali di stimolo provenienti dalle MSC. I nostri risultati indicano che sia il diretto contatto cellula-cellula che la presenza di molecole solubili sono coinvolte nell’interazione tra le cellule B leucemiche e le MSC, promuovendo la sopravvivenza e la migrazione della cellula B leucemica. Successivamente, abbiamo valutato l’effetto delle MSC sui linfociti B neoplastici durante un trattamento chemioterapico di uso comune nella pratica clinica. I nostri dati hanno dimostrato che le MSC sono in grado di proteggere le cellule B leucemiche dall’apoptosi durante il trattamento con Fludarabina e Ciclofosfamide, sia in vitro che in vivo. Abbiamo esaminato il ruolo protettivo delle MSC anche durante il trattamento dei linfociti neoplastici con Ibrutinib, un nuovo inibitore della Btk, una chinasi coinvolta nella cascata del segnale del BCR, e abbiamo dimostrato che il trattamento delle cellule B con Ibrutinib è in grado di contrastare l’effetto anti-apoptotico delle MSC. Per meglio definire l’azione di Ibrutinib nell’interazione tra le cellule B di LLC e le MSC, abbiamo valutato il suo ruolo sulla mobilità dei linfociti B leucemici, analizzando inoltre i livelli di espressione di CCR7 e CXCR4, due recettori chemiochinici fondamentali nella migrazione del clone neoplastico. Abbiamo dimostrato che la migrazione delle cellule B neoplastiche non è significativamente influenzata dall’inibitore del Btk; inoltre, considerando che il diretto contatto cellula-cellula con le MSC è di notevole importanza per la sopravvivenza dei linfociti B leucemici, abbiamo analizzato l’adesione delle cellule B alle MSC dopo il trattamento con Ibrutinib, evidenziando che la loro adesione era significativamente ridotta. In questa tesi abbiamo dimostrato che le MSC incrementano la sopravvivenza delle cellule B neoplastiche attraverso il rilascio di fattori solubili e mediante il diretto contatto cellula-cellula, e che ogni clone leucemico rivela una peculiare risposta ai segnali anti-apoptotici rilasciati dalle MSC. Queste osservazioni potrebbero essere determinanti al fine di identificare i pazienti più sensibili a trattamenti mirati a colpire il microambiente midollare ed a trovare potenziali nuove strategie terapeutiche per la LLC. Una migliore comprensione della complessità delle interazioni tra i linfociti leucemici e il loro microambiente nel corso del trattamento potrà inoltre aiutare a chiarire i meccanismi di chemioresistenza e refrattarietà, così come a pianificare studi clinici randomizzati che confrontino nuovi farmaci e la loro combinazione con i trattamenti chemio-immunoterapici già in uso.