Investigation of Metabolic Heterogeneity and Clonal Selection Driven by anti-VEGF therapy in Ovarian Cancer

Il processo di trasformazione neoplastica è associato ad un profondo cambiamento metabolico che comprende anche l’ampiamente studiata modulazione del metabolismo del glucosio. È inoltre sempre più apprezzato il fatto che i tumori sono metabolicamente eterogenei, compresa l'eterogeneità metabolica intra- e inter-tumorale. Tuttavia, non è ancora stato ampiamente studiato se questo fenomeno dipenda dall’esistenza di sottopopolazioni tumorali dotate di caratteristiche metaboliche diverse oppure da modulazioni locali del metabolismo associato a fattori del microambiente, come per esempio l’ipossia. In base a queste osservazioni, abbiamo recentemente dimostrato che la terapia che prevede l’utilizzo di un anticorpo monoclonale anti-VEGF, Bevacizumab, induce un cambiamento metabolico stabile in xenotrapianti di cancro ovarico epiteliale che correla con un’aumentata aggressività tumorale e la resistenza alla terapia anti-angiogenica. Lo scopo di questo progetto è quello di indagare se esiste eterogeneità a livello clonale in colture di cellule tumorali e di studiare l’aspetto metabolico associato a questo fenomeno. Abbiamo voluto stabilire se alcune terapie mirate possano modificare il metabolismo tumorale, grazie alla selezione di varianti metaboliche scarsamente rappresentate nel tumore originale e quando sia possibile, trattare queste cellule tumorali con un inibitore diverso dal Bevacizumab. Per raggiungere questi obiettivi, abbiamo inizialmente isolato, usando diluizioni seriali, diversi cloni (n = 10-35) da linee cellulari di cancro ovarico, precedentemente caratterizzate per la loro attività glicolitica. Infatti, le cellule IGROV-1 e SKOV3 sono prototipi di cellule scarsamente glicolitiche, mentre le cellule OC316 sono altamente glicolitiche. Le linee cellulari di cancro ovarico OAW42, A2780 e A2774 hanno mostrato un profilo glicolitico intermedio rispetto alle cellule IGROV-1 e OC316, in accordo con le misure della produzione di lattato e del consumo del glucosio in vitro. Abbiamo ipotizzato che cellule altamente glicolitiche potrebbero essere relativamente dipendenti dal glucosio e quindi meno tolleranti se nel terreno di coltura manca questo nutriente, rispetto alle cellule scarsamente glicolitiche. Per verificare questa ipotesi, abbiamo coltivato i cloni in presenza o in assenza di glucosio (2 g/l) nel terreno di coltura. Dopo 72h in cui i cloni sono stati sottoposti a deprivazione di glucosio, sono stati valutati attraverso la microscopia ottica. Abbiamo usato l'acronimo GDS per riferirci ad un clone sensibile alla deprivazione di glucosio e GDR per indicare un clone relativamente resistente alla deprivazione di glucosio. I risultati hanno mostrato che i cloni derivanti dalla coltura cellulare OC316 erano esclusivamente del tipo GDS, mentre nelle linee cellulari IGROV-1 e SKOV3 erano presenti entrambi i due sottogruppi di cloni GDR (55%) e cloni GDS (45%). La linea cellulare OAW42 era composta per il 68% da cloni GDR e per il 32% da cloni GDS, invece le linee A2780 e A2774 hanno mostrato un alto arricchimento nella % di cloni GDR. Il fenotipo GDR/GDS è sostanzialmente stabile anche dopo settimane di analisi. Inoltre, abbiamo osservato che i cloni GDS non esprimono livelli più elevati di trascritti collegati con la via glicolitica e neanche livelli più elevati di produzione di lattato rispetto ai cloni GDR. Abbiamo effettuato un'analisi con la metodica del Seahorse e abbiamo osservato che il tasso di consumo di ossigeno era aumentato nel gruppo dei GDR rispetto ai cloni GDS. L'analisi metabolomica ha mostrato che la maggior parte delle vie diversamente regolate era legata alla funzione mitocondriale nei cloni GDR. Inaspettatamente, non abbiamo potuto discriminare i cloni GDS per la loro attività glicolitica ma abbiamo notato una possibile alterazione dell’attività mitocondriale nel gruppo dei cloni GDR rispetto ai cloni GDS. Abbiamo anche valutato la modulazione di diverse vie metaboliche nei cloni GDR e GDS in condizioni di deprivazione di glucosio. Successivamente, abbiamo isolato i cloni GDR e GDS da colture cellulari ex vivo derivanti da tumori IGROV-1 trattati con Bevacizumab o di controllo. Abbiamo indagato se la terapia anti-angiogenica porta ad un’alterazione del rapporto GDR/GDS. Nel caso dei tumori di controllo, la percentuale dei cloni GDR e GDS isolati, era simile a quella trovata nelle cellule parentali IGROV-1. Le colture cellulari derivate da tumori trattati con Bevacizumab hanno mostrato un arricchimento nel numero di cloni GDR. Questo può suggerire che la terapia anti-VEGF perturba l’eterogeneità metabolica tumorale.