Wilms' tumor suppressor gene (WT1) loss in T-cell acute lymphoblastic leukemia promotes cell survival and resistance to DNA damage

La leucemia linfoblastica acuta a cellule T (LLA-T) è un tumore ematologico derivante dalla trasformazione neoplastica dei progenitori dei linfociti T. Grazie ai numerosi progressi effettuati nelle tecniche di biologia molecolare, numerose alterazioni genetiche sono state identificate nei pazienti affetti da LLA-T, generando nuove opportunità per la messa a punto di una terapia più mirata. Delezioni e mutazioni a carico del gene WT1 sono state identificate nel 10-12% dei pazienti affetti da LLA-T, ma tuttora gli effetti derivanti da tali alterazioni non sono stati ancora ben chiariti. Il gene WT1 codifica per un fattore di trascrizione caratterizzato da diverse isoforme derivante da splicing alternativo. Le isoforme sono conservate in tutti i vertebrati ma differiscono tra loro per la presenza o assenza dell'esone 5 e di un tripeptide composto dagli amminoacidi lisina-trenonina-serina (KTS), a cavallo tra il terzo e quarto dominio zinc finger. Le isoforme prive del KTS (KTS') possiedono una forte affinità nel legare il DNA e quindi sono in grado di regolare la trascrizione dei geni bersaglio. La nostra ipotesi è che WT1 agisca come oncosopressore in condizioni di aplo-insufficienza nella LLA-T e che la sua assenza comporti un'alterata regolazione del suo assetto trascrizionale. In questo studio sono stati analizzati gli effetti della sovra-espressione di WT1, sia delle isoforme normali che di un caratteristico mutante trovato nella LLA-T, sulla sopravvivenza e proliferazione delle cellule leucemiche. Abbiamo osservato che esclusivamente le isoforme (KTS') erano in grado di influenzare negativamente la crescita delle cellule leucemiche e di diminuire la loro capacità di formare colonie in soft-agar. La sovra-epressione delle isoforme derivate da una caratteristica mutazione frameshift (E384Stop) nell'esone 7 del gene WT1, invece, non produceva alcun effetto sulla crescita delle cellule di LLA-T. Per mimare la deplezione di WT1 abbiamo indotto il silenziamento del gene nella linea cellulare di leucemia MOLT4 e abbiamo valutato l'effetto sulla crescita delle cellule mediante saggio clonogenico. Abbiamo riscontrato che le cellule leucemiche con bassi livelli di espressione di WT1 presentavano un significativo incremento di colonie rispetto alle cellule di controllo. Questi risultati suggeriscono che le mutazioni di WT1 possano determinare l'aplo-insufficenza del gene nelle cellule di LLA-T, favorendo la crescita e lo sviluppo tumorale. Allo scopo di valutare se le mutazioni a carico di WT1 potessero indurre un'alterazione del suo assetto trascrizionale in cellule di LLA-T, ci siamo focalizzati nellâ analisi dei suoi bersagli dopo deplezione di WT1 in una linea cellulare di LLA-T. Mediante lâ analisi di immunoprecipitazione della cromatina su tecnologia microarray (Chromatin Immunoprecipitation on chip; ChIP-chip), effettuata nella linea cellulare MOLT4, abbiamo ottenuto circa 800 geni regolati direttamente da WT1 nella LLA-T. Analisi bioinformatiche hanno dimostrato un arricchimento di questi geni in alcune vie di segnale implicate nella risposta allo stress cellulare: la via di attivazione di p53, le vie coinvolte nella riparazione del DNA dopo danno cellulare e la via di segnalazione della Mitogen-Activated Protein (MAP) chinasi. Integrando lâ analisi ChIP-chip con l'analisi del profilo di espressione genica, ottenuta dopo silenziamento di WT1 nelle cellule MOLT4, abbiamo ulteriormente definito i bersagli diretti di WT1 che risultano anche de-regolati nella LLA-T. Questi risultano arricchiti nella via di segnalazione delle MAP chinasi. Prendendo spunto da questi risultati, abbiamo infine verificato se la ridotta espressione di WT1 nelle cellule di LLA-T, sia in linee cellulari che in campioni primari derivanti da pazienti affetti da LLA-T, ne favorisca la sopravvivenza in seguito a danno al DNA, per esempio dopo trattamento con radiazioni ionizzanti o farmaci chemioterapici. Le analisi della vitalità cellulare e dell'apoptosi di queste cellule hanno chiaramente mostrato come le alterazioni di WT1 inducano una maggior resistenza a condizioni di stress, in quanto vanno ad interferire con la trascrizione di importanti geni apoptotici, soprattutto quelli a valle di p53. In particolare l'induzione del gene BBC3/PUMA, un fattore chiave nella risposta apoptotica, è significativamente più elevata nelle cellule in cui WT1 e p53 risultano funzionali. In conclusione, analizzando l'effetto della perdita dellâ espressione di WT1 nella LLA-T, abbiamo riscontrato un'alterata regolazione di numerosi geni coinvolti nella patogenesi della LLA-T, in particolare quelli responsabili della risposta cellulare in seguito al danno al DNA, suggerendo ulteriormente un ruolo di WT1 come gene oncosopressore in questa neoplasia.