Explorin the role of FIS1 in mitochondrial (patho)physiology

I mitocondri svolgono una funzione chiave in una serie di processi (pato)fisiologici e presentano una sorprendente versatilità morfologica e strutturale, assicurata da processi di fusione e fissione mitocondriali. Quest’ultimi sono mediati da un gruppo di ATPasi simili alla dinamina e dalle loro proteine adattatrici, dette mitochondrial shaping proteins (Friedman and Nunnari, 2014; Hoppins et al., 2007a). La fissione mitocondriale richiede la traslocazione di dynamin related protein 1 (DRP1) dal citosol ai mitocondri e la sua interazione con FIS1, MFF e MiD49/50, i suoi recettori putativi. In particolare, FIS1 è una proteina legata alla membrana mitocondriale via l’N-terminale, distribuita in maniera regolare nella membrana e composta da un dominio transmembrana C-terminale (TM) e due motivi a ripetute tetratricopeptidiche (TRP) citosolici (James et al., 2003; Stojanovski et al., 2004; Yoon et al., 2003). E’ stato dimostrato che FIS1 media il collegamento tra mitocondri e reticolo endoplasmatico (ER), l’apoptosi via ER, l’autofagia, e la frammentazione mitocondriale indotta da ischemia/ipossia (Alirol et al., 2006; Iwasawa et al., 2011a; Kim et al., 2011; Shen et al., 2014; Yamano et al., 2014). Tuttavia, la scoperta di MFF e MiD49/50, insieme ai risultati sperimentali che sia il reclutamento di DRP1 che la frammentazione mitocondriale si svolgono anche in due modelli di ablazione di Fis1 in vitro, hanno portato in parte a smentire il coinvolgimento di FIS1 in tali eventi (Loson et al., 2013; Otera et al., 2010; Palmer et al., 2013). Oltre agli aspetti meccanicistici della frammentazione mediata da FIS1, la sua rilevanza (pato)fisologica è tutt’altro che chiara e fino ad ora nessuna patologia umana è stata legata direttamente a mutazioni nel gene Fis1. Per collocare le funzioni di FIS1 in un contesto fisiologico e meglio definire l’importanza della fissione mitocondriale in vivo abbiamo deciso di generare un modello murino ipomorfico di Fis1 (allele Fishyp) che possa essere convertito in un sistema per l’ablazione condizionale di Fis1 (allele Fis1fl). Il potente strumento genetico da noi generato evita molti dei potenziali problemi caratteristici degli approcci più comunemente usati per intervenire su un gene. Abbiamo scoperto che l'ipomorfismo di Fis1 causa un fenotipo pleiotropico con letalità perinatale che comprende una grave atrofia muscolare progressiva, ischemia cardiaca e danni all'integrità dei vasi sanguigni. L’atrofia muscolare in concomitanza con ischemia cardiaca parrebbe suggerire una (cardio)miopatia e/o difetti neuromuscolari, mentre gli estesi coauguli nel torace, la presenza di sangue nei polmoni e nell'intestino, e la microcircolazione alterata nella retina paiono suggerire difetti nel mantenimento dell’integrità dei vasi sanguigni e/o un aumento della permeabilità dei vasi sanguigni con conseguenti emorragie. Anche topi eterozigoti mostrano letalità, benché in misura ridotta ed ad uno stadio più tardo, e hanno difetti comparabili a quelli esibiti dai topi Fis1hyp/hyp, suggerendo così una relazione dose-dipendente tra severità del fenotipo ed entità dell’ablazione del gene Fis1. Per verificare tale ipotesi è necessaria una misura della produzione residuale di mRNA di Fis1 via 5’RACE seguita da una correlazione tra i livelli residuali di mRNA di Fis1 in topi Fishyp/+ e severità del fenotipo. In conseguenza dell'ipomorfismo di Fis1 abbiamo osservato in vitro un’elongazione dei mitocondri e una regolazione su livelli più alti delle proteine coinvolte nella fissione mitocondriale. Un altro risultato è stato la dimostrazione che l’espressione dei geni Fis1 umano e murino è controllata da splicing multiplo. In particolare, un evento di salto di esone dell’esone 2, conservato in entrambe le specie, determina l’espressione preferenziale della variante 2 rispetto alla variante canonica 1 in entrambe le specie. E’ notevole che un codone START non canonico sembri essere responsabile della trascrizione della variante umana 2 (hFis1.2). La proteina risultante, benché manchi solo dei primi 18 amminoacidi, induce elongazione dei mitocondri se overespressa in topo. In caso di starvation, l’espressione della variante 2 di Fis1 viene regolata su livelli più alti in maniera dipendente da protein kinase A e il suo knockdown specifico inibisce l’elongazione mitocondriale indotta da autofagia: ne deriva che Fis1 è soggetto ad uno splicing alternativo per modulare la morfologia mitocondriale durante l’autofagia