Anti HIV-1 gene therapy approach combining multiple siRNAs with the membrane-anchored fusion inhibitor C-peptide maC46

La storia naturale dell’infezione da HIV-1 e il relativo approccio terapeutico hanno stimolato la comunità scientifica a porsi una serie di interrogativi. Negli ultimi anni sono state introdotte diverse classi di nuovi farmaci, tra cui inibitori nucleosidici e nucleotidici della trascrittasi inversa (NRTI), inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa (NNRTI), inibitori della proteasi (PI), dell’integrasi (IN), inibitori di entrata (i.e. antagonisti del corecettore CCR5 e inibitori di fusione), in grado di ridurre notevolmente la carica virale per ristabilire un certo grado di immunocompetenza da parte dell’ospite e sono stati sperimentati protocolli terapeutici caratterizzati da loro combinazioni, come avviene nel regime polifarmacologico della “terapia antiretrovirale altamente attiva” (HAART). Tuttavia, questi trattamenti non sono ancora del tutto esenti da limiti. Infatti, la non eradicabilità dell’infezione, correlata alla persistenza del virus in determinati distretti anatomici e cellulari (reservoir di infezione), obbliga ad un regime terapeutico a tempo indefinito, imponendo, quindi, nuove problematiche quali l’insorgenza di specie virali farmaco-resistenti, la tossicità d’organo, le interazioni farmacologiche dei farmaci somministrati e, non ultimi, gli elevati costi. Ciò ha favorito e incrementato lo sviluppo di strategie alternative e/o complementari per la cura dell’infezione da HIV-1. Il primo importante successo nella cura dell’infezione da HIV-1 è stato ottenuto in un paziente leucemico HIV-1-positivo, in seguito al trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (HSCs), intrinsecamente resistenti all’infezione a causa di una delezione a livello del corecettore virale CCR5 (recettore C-C per le chemochine di tipo 5). Tuttavia, il potenziale rischio di rigetto e la difficoltà di reperire donatori compatibili, non ne consentono un’applicazione diffusa. Pertanto, un possibile approccio alternativo è rappresentato dalla terapia genica, finalizzata all’espressione di geni anti-HIV-1 nelle cellule bersaglio dell’infezione, preferenzialmente nelle HSCs, cellule totipotenti in grado di differenziarsi verso tutte le linee emopoietiche coinvolte nella patogenesi dell’infezione, per generare un sistema immunitario permanentemente resistente al virus, a seguito di un singolo trattamento. In particolare, gli inibitori dell’ingresso o delle fasi iniziali della replicazione virale che precedono l'integrazione del genoma virale nel DNA cromosomico della cellula ospite possono prevenire l'instaurarsi di una infezione cronica, portando ad un vantaggio selettivo delle cellule modificate. D’altro canto, un ulteriore vantaggio consiste nella possibilità di prevenire le mutazioni che insorgono nel processo di trascrizione inversa. Un obiettivo importante della terapia genica consiste nell’agire contemporaneamente nei confronti di più siti virali e fattori cellulari endogeni, in modo da interferire con diverse fasi del ciclo replicativo, mimando il consolidato approccio terapeutico polifarmacologico, con l’intento di ridurre al minimo la probabilità di insorgenza di varianti virali resistenti. A tal proposito, la strategia degli RNA interference (RNAi) rappresenta un valido strumento per silenziare l'espressione genica post-trascrizionale. Molteplici short hairpin (sh)RNA diretti verso trascritti virali e cellulari possono essere combinati all’interno di un vettore lentivirale “self inactivating” di terza generazione (SIN). Questi vettori sono in grado di conferire un’espressione stabile e duratura nel tempo dei transgeni, grazie all’integrazione nel DNA cromosomico della cellula ospite, caratteristica importante e necessaria ai fini terapeutici di una patologia cronica come l’infezione da HIV-1. Sulla base di tali presupposti, sono state precedentemente sviluppate in laboratorio diverse combinazioni di vettori lentivirali esprimenti small interfering RNA (siRNA) diretti contro regioni altamente conservate di geni target cellulari (come CCR5) e virali (come vif, tat e rev) allo scopo di interferire con diverse fasi del ciclo replicativo di HIV-1. Nello specifico, due short hairpin (sh)RNA, codificanti un singolo siRNA diretto contro il trascritto del gene cellulare CCR5 (shCCR5) e del gene virale vif (shvif) ed un long hairpin (lh)RNA, codificante due siRNA diretti contro il trascritto comune del primo esone dei geni tat e rev (lhtat/rev), sono stati posti sotto il controllo di diversi promotori umani della polimerasi III (tra i quali U6, 7SK, H1), sia come unità trascrizionali indipendenti, sia come extended short hairpin RNA (e-shRNA), in grado di esprimere i tre siRNA sotto il controllo di un singolo promotore. Dopo aver verificato che l’attività di silenziamento dei diversi siRNA fosse stabile e funzionale, studi di inibizione della replicazione virale condotti sia in linee cellulari che in cellule umane primarie, hanno portato all’identificazione di due vettori (pLL3.7 U6shCCR5-7SKshVif-H1lhTat/Rev e pLL3.7 H1e-shRNA), capaci di conferire un’efficiente protezione nei confronti di ceppi di laboratorio di HIV-1. Tuttavia, l’ingresso di HIV-1 all’interno della cellula ospite può essere mediato anche da un altro corecettore, CXCR4, il quale risulta meno favorevole al silenziamento genico da parte di siRNA o alla distruzione ad opera delle emergenti tecniche di gene editing, essendo coinvolto in importanti funzioni fisiologiche, in particolare nel processo di maturazione delle cellule staminali ematopoietiche. Allo stesso tempo, i virus CXCR4-tropici (X4) sono rilevanti nella patogenesi dell' AIDS. Pertanto, con l’intento di conferire una protezione ad ampio spettro, i vettori precedentemente selezionati sono stati ottimizzati mediante l’inserimento di un inibitore di fusione, appartenente alla classe dei peptidi sintetici C, derivati dalla porzione C-terminale della subunità gp41 della glicoproteina dell’envelope di HIV-1. In particolare, è stato dimostrato che la forma di peptide ancorata alla membrana (maC46), quando viene espressa sulla superficie di cellule geneticamente modificate, è in grado di proteggere queste ultime dall’infezione da parte di un’ampia gamma di isolati clinici e di ceppi di laboratorio di HIV-1, fornendo inoltre un notevole vantaggio selettivo rispetto a cellule non esprimenti il peptide. La cassetta trascrizionale di maC46, inserita all’interno dei vettori selezionati come unità singola o in frame con il gene reporter eGFP, è stata posta sotto il controllo del promotore umano Elongation Factor 1 (EF1), in grado di indurre elevati livelli di espressione del transgene in cellule staminali ematopoietiche. Inoltre, i nuovi vettori sviluppati presentano una versione ottimizzata del Wooodchuck Hepatitis Virus post-trascriptional regulatory element (WPRE*), privato del potenziale oncogeno, per garantire maggiore sicurezza dal punto di vista terapeutico, ma al contempo in grado di mantenere gli stessi livelli di espressione del transgene. Dopo aver testato, mediante tecniche di immunofluorescenza diretta, l’effettiva localizzazione del peptide maC46 a livello della membrana cellulare, sono state prodotte particelle lentivirali ricombinanti in cellule embrionali di rene umano (293T), il cui titolo è stato determinato mediante saggio di attività retrotrascrittasica (RT Assay) ed analisi citofluorimetrica (Fluorescence-activated cell sorting, FACS). La valutazione del contributo antivirale del peptide maC46, in combinazione con l’attività di silenziamento, dovuta alla presenza di siRNA espressi dai vettori lentivirali, è stata effettuata in esperimenti di challenge, in cui linee cellulari T-linfoblastoidi CD4+, opportunamente trasdotte con le particelle ricombinanti, sono state infettate con il clone molecolare di HIV-1 HXBc2 Vpr+/Vpu+/Nef+ X4-tropico, utilizzando diverse molteplicità di infezione. Parallelamente, in collaborazione con il gruppo di ricerca del professor Christopher Baum del Dipartimento di Ematologia Sperimentale della Scuola Medica di Hannover, è stato testato il potenziale rischio di mutagenesi inserzionale dei vettori, valutazione indispensabile prima di poter procedere all’impiego del modello animale, alla manipolazione di cellule staminali e, in futuro, ad una applicazione clinica. Per tali motivi, i vettori sono stati sottoposti al saggio di immortalizzazione cellulare in vitro. I risultati ottenuti fino ad ora hanno chiaramente dimostrato che i vettori sviluppati, in cui è stato combinato per la prima volta un potente inibitore di fusione con tre siRNA, sono estremamente promettenti in termini di attività antivirale nella linea cellulare linfoblastoide impiegata. Inoltre, tali vettori si sono dimostrati incapaci di indurre effetti genotossici. L’obiettivo ultimo del più ampio progetto di ricerca, in cui si inserisce il presente lavoro, consiste nell’accertare l’efficacia e la sicurezza di tali vettori in modelli animali, per giungere infine alla manipolazione genetica di HSCs derivanti da pazienti HIV+ affetti da linfoma, i quali rappresentano la popolazione ideale in un contesto clinico eticamente accettabile, poiché sono spesso sottoposti a trapianto di HSCs.