Set up of different strategies to selectively target Glioblastoma Cells

Il Gliobalstoma multiforme (GBM) è il più comune e maligno dei tumori cerebrali nell’adulto, caratterizzato da una rapida crescita, proliferazione vascolare e diffusa infiltrazione nel parenchima cerebrale. Nonostante negli ultimi anni siano stati fatti notevoli progressi terapeutici che includono la rimozione chirurgica della massa, seguita da radioterapia e chemioterapia, la prognosi ancora oggi permane particolarmente infausta con una sopravvivenza media di circa 14 mesi dalla diagnosi. Ciò pare sia associato anche all’esistenza nel cervello di una popolazione di cellule definita “Cancer Stem Cells” (CSCs). Tali cellule vengono definite Glioma Stem Cells (GSCs) e, al pari delle normali cellule neuronali staminali, sono caratterizzate da capacità di auto-rinnovamento, sono multipotenti, nonché tumorigeniche in vivo. Inoltre, le GSCs sembrano svolgere un ruolo importante nell’insorgenza e la progressione del GBM, contribuendo appunto alla resistenza alla chemioterapia e alla radioterapia, oltre ad essere responsabili delle recidive di tale tumore. A fronte di tutto ciò, si rende quindi necessario più che mai lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche che siano particolarmente selettive e mirate a colpire la popolazione delle GSCs. In questo lavoro di tesi, abbiamo posto la nostra attenzione in particolare a due strategie: - L’uso delle Cellule Staminali Mesenchimali (MSCs) come sistemi di delivery cellulari per composti attivi contro i tumori cerebrali sfruttando il loro intrinseco tropismo per il letto tumorale per effetto di citochine e chemochine rilasciate dai tessuti infiltrati. - L’utilizzo di un virus oncolitico di tipo herpetico, R3616, ingegnerizzato per colpire selettivamente le cellule tumorali e non causare neurovirulenza, essendo stato deleto dei geni γ34.5 responsabili dell’insorgenza di encefalite. L’effetto di queste delezioni inoltre comporta inibita autofagia e attenuata replicazione anche nelle stesse GSCs. Le GSCs utilizzate per i nostri esperimenti sono state derivate da biopsie di pazienti affetti da GBM e coltivate in adesione al 21% che al 2% di O2 o in sospensione al 21% di O2 come neurosfere secondo i parametri previsti da protocolli accettati in letteratura. Le cellule cresciute come neurosfere sono state caratterizzate fenotipicamente con alcuni dei più comuni marcatori di staminalità, tra cui il CD133, la Nestina, Sox2 e il CD44. Per gli esperimenti di delivery cellulari sono state inizialmente valutate le hMSCs isolate dai campioni di midollo osseo derivanti da donatori sani (BM-MSCs) e da tessuto adiposo (AT-MSCs) cerebrale prelevato durante l’intervento di rimozione chirurgica di GBM dello stesso paziente. Le MSCs appartenenti ad entrambe le fonti sono state immuno-fenotipicamente caratterizzate e coltivate in ipossia e in normossia al fine di valutarne la capacità e l’efficienza di crescita ricreando il tipico microambiente del GBM verso cui poi le cellule dovrebbero essere fatte migrare. Saggi a.) di crescita, b.) di differenziamento in vitro e c.) di migrazione hanno evidenziato come le BM-MSCs migrino in maniera più efficiente e selettiva delle AT-MSCs verso le cellule tumorali, specie in condizioni ipossiche. Pertanto, le BM-MSCs sono state scelte come modello di delivery cellulare per proseguire i nostri esperimenti. Inoltre abbiamo visto come questa migrazione avvenga anche verso cellule tumorali pre-trattate con fattori morfogeni ad effetto pro-differenziativo nei gliomi, quali BMP2 e WNT3a. Le BMPs sono membri della Famiglia del Transforming Growth Factor-β (TGF-β), e sono in grado a livello cerebrale di portare ad arresto del flusso mitotico, blocco della proliferazione cellulare e ad un’azione di differenziamento in senso gliale aumentando la percentuale di cellule a fenotipo GFAP+. Il Wnt3a è noto essere invece un ligando in grado di promuovere il differenziamento in senso neuronale e inibire la proliferazione cellulare, specie in ipossia. Per gli esperimenti di Virotherapy si è innanzitutto valutata la capacità di replicazione e di morte cellulare del virus deleto R3616 paragonandola all’ efficienza dell’HSV1 wild type nelle GSCs. R3616 ha dimostrato un’efficienza di replicazione e di uccisione attenuata rispetto all’HSV1 wild type. Entrambi i virus sono stati poi testati per valutare la capacità di replicazione e di killing nelle BM-MSCs. Rispetto all’ HSV1 wild type, R3616 ha riportato una minore citotossicità e compromessa capacità di replicazione. L’efficienza di migrazione delle BM-MSCs è stata poi valutata in GSCs infettate sia con HSV1 wt, sia con R3616. In entrambi i casi è trovato un aumentato tropismo delle BM-MSCs, specie quando le GSCs erano state infettate con R3616. In conclusione in questo lavoro, proponiamo l’utilizzo di cellule staminali mesenchimali come veicolo per trattare il Glioblastoma con molecole fisiologiche ad azione pro-differenziativa così da aumentarne la risposta agli attuali trattamenti chemioterapici. Inoltre, l’aumentata efficienza di migrazione insieme alla capacità di uccisione selettiva delle GSCs riscontrata nell’utilizzo di R3616, incoraggiano a un trattamento di combinazione dei due possibili approcci. Risultati preliminari hanno già evidenziato come GSCs infettate con R3616 e trattate con BMP2 siano in grado di aumentare l’espressione dei canonici marcatori di differenziamento cellulare e ciò incoraggia a valutare se tale effetto possa stimolare ulteriormente l’efficienza e aumentare la selettività di migrazione delle BM-MSCs.