Structure and interactions of the STAS domains and of the Myb/SANT domains by means of NMR techniques

Il presente lavoro è stato suddiviso in due parti: la prima concernente i domini STAS, mentre la seconda i domini Myb/SANT. Il fil rouge che unisce le due parti è costituito dalla metodica e dagli scopi, ovvero lo studio della struttura e delle interazioni di questi domini tramite NMR in soluzione. La prima famiglia di domini trattati, gli STAS (Sulphate Transporter and Anti Sigma factor antagonist), è stata originariamente classificata sulla base della similarità con gli ASA (Anti Sigma factor Antagonist), domini batterici contenuti in proteine coinvolte in risposte contro gli stress ambientali e nell’induzione della sporulazione. Gli STAS sono presenti in piante, batteri, funghi e animali, in proteine con i ruoli più diversi, come sensori di luce, ossigeno, nucleotidi ciclici, trasportatori vari, ecc... Presentano una struttura con cinque β-sheets e quattro α-eliche, intercalati in maniera irregolare. Le strutture di domini STAS di trasportatori attualmente note (Protein Data Bank, Gennaio 2013) sono cinque: quattro batteriche, una di mammifero, nessuna di vegetale. L’unica struttura nota di mammifero corrisponde allo STAS di prestina di Rattus norvegicus, mancante della Intervening Sequence (IVS), una sequenza variabile da proteina a proteina della stessa famiglia: uno degli obiettivi consisteva nell’ottenere questo dominio completo. La succitata prestina fa parte della famiglia degli SLC26A, trasportatori anionici transmembrana con un ruolo nel mantenimento dell’equilibrio elettrolitico a livello degli epiteli. Prestina però è un membro anomalo di questa famiglia, in quanto, nei mammiferi, non funziona da trasportatore bensì da proteina motore nell’amplificazione cocleare del suono. Oltre all’interesse per lo studio del suo dominio completo dello STAS di prestina, l’attenzione è stata focalizzata anche su possibili partner di interazione. Uno di essi, ipotizzato sulla base sul modello di attivita di un trasportatore di ammonio in cui un dominio C-terminale interagisce con un loop citoplasmatico, poteva essere il cosiddetto motivo di Saier, costituito da una tripletta di amino acidi ripetuta abbastanza conservata. Il costrutto del motivo di Saier è stato modellato sui dati strutturali ottenuti sul trasportatore batterico BicA, un modello che si è dimostrato non applicabile per prestina, in quanto il costrutto, una volta clonato ed espresso, ha mostrato gravi problemi di solubilità in fase di purificazione, già a livello di proteina di fusione. Il dominio STAS su cui sono stati concentrati i maggiori sforzi è quello appartenente al trasportatore di solfato SULTR1;2 di Arabidopsis thaliana. Questo proteina presenta una intervening sequence di soli 10 aminoacidi e attualmente non sono note strutture di STAS vegetali. Dopo una prova preliminare con un costrutto del dominio già disponibile in laboratorio, ne sono stati clonati e testati altri cinque che differivano tra loro nella lunghezza della prozione N-terminale della sequenza.. Non è stato tuttavia possibile ottenere un campione adatto per studi NMR ma è stato scelto il costrutto più promettente per ottimizzazione del tampone finale, sul quale nuovi tentativi sono in programma. La seconda parte del progetto, svolta presso lo Structural Genomics Consortium (SGC) di Toronto, Canada, ha riguardato i domini Myb/SANT. Questi domini di circa 50 amino acidi presentano entrambi una struttura con tre eliche, dove la seconda e la terza elica (quelle più C-terminali) costituiscono un motivo Helix-Turn-Helix (HTH). Elementi addizionali, come ulteriori eliche o β-hairpins, possono essere presenti. Ciò che li differenzia è la distribuzione della carica superficiale: positiva sulla terza elica e negativa sulla prima elica per i Myb, invertita per i SANT. I Myb sono noti principalmente come domini che legano il DNA con la loro terza elica, anche se nuove evidenze dimostrano che la prima elica può interagire con le code basiche degli istoni; i SANT invece legano le code degli istoni con la terza elica. Le strutture di due domini di questa famiglia sono stati risolti e presentati in questo lavoro: la ripetizione R1 del DNA-binding domain della proteina hDmp1 e il dominio SANT2 di NCoR2. hDmp1 è un oncosoppressore che contiene un DNA-binding domain costituito da tre ripetizioni imperfette: è stata risolta la struttura della ripetizione più N-terminale, R1, che ha dimostrato la tipica struttura a tre eliche dei Myb e le stesse proprietà elettrostatiche di superficie. Tuttavia, questa porzione del dominio non si lega al DNA, di cui sono state testate sequenze note e altre nuove. Questo è in accordo con quanto è già noto sui DNA-binding domain di struttura simile, dove l’interazione con il DNA riguarda solo le ripetizioni R2 e R3, mentre R1 sembra avere una funzione accessoria. L’altro dominio risolto è il SANT2 di NCoR2, una proteina che agisce da repressore dei recettori nucleari in assenza di ligando. Questa proteina possiede due domini SANT: la struttura di quello situato nell’estremità più N-terminale è già stata risolta (PDB: 1XC5) e studiata, in particolare come partner di interazione dell’enzima istone deacetilasi 3 (HDAC3). Il dominio SANT2 ha dimostrato però proprietà peculiari e differenti dai SANT: oltre ad avere una lunga elica addizionale all’estremità C-terminale e una zona di conformational averaging tra questa elica e quella precedente, presenta proprietà elettrostatiche di superficie tipiche dei Myb, non dei SANT. Non sono note interazioni con il DNA, ma con le code istoniche dell’istone H4, con cui sono stati fatti degli esperimenti di binding monitorati tramite 15N-HSQC. La regione interessata da questo legame però confina con una mutazione che è stata rilevata nel campione NMR in fase di assegnazione: è quindi in programma la produzione della proteina wild-type e la ripetizione degli esperimenti con le code di H4.