Novel LRRK2 substrates at the presynaptic site in vesicle recycling pathways in Parkinson's disease

La malattia di Parkinson (PD) è la seconda malattia neurodegenerative più comune dopo la malattia di Alzheimer (AD) e colpisce circa l’1-2% della popolazione oltre I 65 anni (Farrer, 2006). Gli elementi caratteristici del morbo di Parkinson sono la perdita dei neuroni nella sustantia nigra pars compacta (SNpc), e la presenza di aggregati proteici intracellulari denominati corpi di Lewy (LB) nei neuroni che sopravvivono (Damier et al., 1999; Frank et al., 2007). L’eziologia della malattia di Parkinson è sconosciuta, con una complessa correlazione tra fattori ambientali e genetici, e fattori legati all’invecchiamento. La maggior parte dei casi, circa 95%, è di origina sporadica, mentre il rimanente 5-10% può essere collegato a mutazioni in singoli geni (Van Den Eeden et al., 2003). La scoperta di geni collegati al morbo di Parkinson ha messo in luce possibili trattamenti terapeutici, dato che la forma sporadica e quella familiare hanno in comune molti meccanismi patologici e pathway compromessi (Lesage and Brice, 2012). Ad oggi, cinque geni sono stati associati alla forma familiare del morbo di Parkinson, sia ad una forma genetica autosomica dominante che recessiva (Valente et al., 2004; Lakshminarasimhan et al., 2008; Nemani et al., 2013; Singleton et al., 2013; Kuang et al., 2013). Per questo motivo, numerosi studi si sono focalizzati sul ruolo fisiologico delle proteine collegate alla malattia di Parkinson e come le mutazioni patologiche causino la patologia. Nel 2004, due studi hanno identificato come mutazioni nel gene Lrrk2 (PARK8) siano causa della forma familiare di morbo di Parkinson (Paisan-Ruiz et al., 2004; Zimprich et al., 2004) e, ad oggi, mutazioni all’interno di questo gene rappresentano la più comune causa genetica di malattia di Parkinson (10%). Lrrk2 Questo gene codifica per la proteina leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2), una grande proteina composta da vari domini con attività GTPasica e chinasica (Marín et al., 2008). La maggior parte delle mutazioni sono localizzate all’interno del core enzimatico della proteina, e possono colpire l’attività di LRRK2 causando un danno alle funzioni cellulari e citotossicità. Tra tutte, la mutazione G2019S è la più frequente (Gilks et al. 2005), quindi la più studiata. Questa mutazione avviene all’interno del dominio chinasico e aumenta l’attività chinasica di LRRK2 (Greggio and Cookson, 2009). Numerosi studi sostengono un ruolo di LRRK2 a livello del traffico delle vescicole sinaptiche, anche se il meccanismo esatto non è ancora chiaro. Perciò, capire quali pathway sono compromessi in condizioni patologiche è fondamentale per sviluppare strategie efficienti contro i danni provocati dalla malattia di Parkinson. Mentre l’inibizione farmacologica di LRRK2 potrebbe bloccare il fenotipo patologico, l’uso di inibitori di LRRK2 ha mostrato effetti secondari gravi a livello degli organi periferici (Baptista et al., 2013; Luerman et al., 2014). Per questo motivo, strategie terapeutiche alternative potrebbero essere dirette verso altre proteine che sono coinvolte all’interno dei pathway di LRRK2. In questo scenario, l’identificazione di substrati di LRRK2 a livello presinaptico, tra tutti i possibili interattori, è fondamentale per capire gli effetti a valle relativi a mutazioni patologiche di LRRK2. Studi precedenti hanno dimostrato che LRRK2 può modulare il traffico delle vescicole sinaptiche attraverso la fosforilazione di componenti facenti parte dei processi di eso- ed endocitosi (Heo et al., 2010; Matta et al., 2012; Yun et al., 2013). Per questa ragione, una domanda ancora senza risposta è quella di identificare possibili substrati dell’attività chinasica di LRRK2, rilevanti a livello fisiologico, e gli effetti che le mutazioni di LRRK2 associate al morbo di Parkinson hanno sulla fosforilazione. In questa tesi, ci siamo focalizzati sulla proteina N-ethylmaleimide Sensitive Fusion (NSF) protein e Rab7L1. Queste due proteine sono state precedentemente indicate come interattori di LRRK2 nei neuroni (Piccoli et al., 2011; MacLeod et al., 2013, Beilina et al., 2014). In questo lavoro, il nostro scopo era quello di testare se queste due proteine siano anche substrati dell’attività chinasica di LRRK2. NSF è classificata come proteina AAA+ (ATPases Associated with various cellular Activities) e la sua funzione è fondamentale a libello presinaptico per un corretto riciclo delle vescicole sinaptiche. In dettaglio, NSF usa l’energia prodotta dall’idrolisi dell’ATP per disassemblare le proteine del complesso SNARE (Soluble N-ethylmaleimide Attachment protein REceptors), insieme alla sua proteina adattatrice alpha-SNAP (Soluble NSF Associated Protein), consentendo un nuovo ciclo di fusione (Zhao and Brunger, 2015). NSF mostra una struttura omo-esamerica, dove ogni monomero è composto da tre differenti domini: l’N-terminale (N-ter) necessario all’interazione con alpha-SNAP ed il complesso SNARE, il dominio D1 con un sito di legame dell’ATP necessaria per l’attività ATPasica, ed un dominio D2 con un altro dito di legame per l’ATP richiesta all’oligomerizzazione (Zhao et al., 2015). Dato che NSF è stato largamente studiato usando una proteina ortologa non umana, abbiamo messo a punto un protocollo per purificare NSF umano con un Flag-tag da cellule di mammifero HEK293T. Per prima cosa, abbiamo deciso di studiare la biochimica di NSF e successivamente la sua interazione con LRRK2. Abbiamo dimostrato che la proteina purificata è attiva ed è in grado di interagire con LRRK2. In particolare, i risultati ottenuti attraverso esperimenti di pull-down rivelano una interazione tra il dominio D2 di NSF e LRRK2. Inoltre, abbiamo dimostrato che NSF è anche un substrato dell’attività chinsica di LRRK2 e questa fosforilazione avviene preferenzialmente nella treonina-645 all’interno del dominio D2. Abbiamo confermato questo risultato misurando l’incorporazione di 33P con saggi chinasici incubando dei mutanti non-fosforilabili di NSF (NSF-T645A, T646A and S647A) insieme a LRRK2 G2019S, Studi cinetici sull’attività ATPasica di NSF hanno rivelato che NSF è due volte più attivo dopo la fosforilazione da parte di LRRK2 G2019S. E’ importante notare che il mutante NSF-T645A, dove l’incorporazione di 33P risulta essere il 50% in meno rispetto al wild-type, non presenta un aumento dell’attività ATPasoca dovuto alla fosforilazione ad opera di LRRK2 G2019S. Inoltre, abbiamo dimostrato che NSF dopo essere stato fosforilato da LRRK2 G2019S disassembla il complesso SNARE più velocemente. Tutti questi risultati evidenziano un possibile meccanismo regolatorio in cui LRRK2 è implicato all’interno del riciclo delle vescicole sinaptiche attraverso la fosforilazione di NSF. L’attività ATPasica di NSF potrebbe quindi essere compromessa da una sua aumentata fosforilazione ad opera del mutante patologico G2019S. Come illustrato precedentemente, un aspetto importante nello sviluppo della malattia di Parkinson potrebbere essere collegato ad un danno nel traffico delle vescicole, che potrebbe far scaturire la neurodegenerazione a stadi precoci (Fernandez-Chacon et al., 2004; Burre et al., 2010). La principale classe di proteine che governa l’organizzazione delle vescicole all’interno della cellula, è composta dalle proteine Rab. Esse costituiscono una vasta famiglia di piccole GTPasi monomeriche associate a tutti i compartimenti cellulari (Grosshans et al., 2006). Nell’uomo ci sono più di 60 tipi di Rab ((Schwartz et al., 2007; Pereira-Leal et al., 2001)) che passando da una forma attiva, legata al GTP, ad una forma inattiva, legata al GDP, regolando la loro interazione con proteine effettrici. Ad oggi, numerosi studi hanno evidenziato una possibile interazione tra LRRK2 e varie proteine Rab (MacLeod et al., 2013; Gomez-Suaga et al., 2014; Dodson et al., 2014; Waschbusch et al., 2014). Nel nostro lavoro, abbiamo testato se alcune proteine Rab siano anche substrati dell’attività chinasica di LRRK2. Abbiamo eseguito saggi chinasici con varie Rab, su Rab7, Rab7L1, Rab9, Rab11 e Rab32. I saggi chinasici hanno rivelato che, tra tutte, solamente Rab7L1 è un substrato di LRRK2, sia wild-type che G2019S. Il gene Rab7L1 è localizzato all’interno del locus PARK16, un locus associato al richio di insorgenza della forma di malattia di Parkinson non-familiare, Rab7L1 è stato trovato associato a LRRK2 nella regolazione della degradazione delle vescicole a livello dell’apparato del Golgi (Beilina 2014). Analisi di spettrometria di massa hano rivelato comee la fosforilazione ad opera di LRRK2 G2019S avvenga preferenzialmente sulla treonina-21 di Rab7L1, un residuo localizzato nella regione altamente conservata responsabile del legame col GTP (P-loop). In aggiunta, abbiamo individuato come meno probabile sito di fosforilazione la serina-22. Per testare quale residuo fosse quello fosforilato, abbiamo generato i mutati non fosforilabili Rab7L1-T21A ed S22A. I saggi chinasici ci hanno indicato che Rab7L1 possiede verosimilmente siti di fosforilazione aggiuntivi, oltre la T21 e la S22, che possono essere fosforilati da LRRK2 G2019S. Riassumendo, questo lavoro ha identificato due nuovi substrati dell’attività chinasica di LRRK2 in vitro con una potenziale rilevanza a livello della malattia. I nostri studi hanno rivelato un aumento dell’attività ATPasica di NSF successivamente alla fosforilazione da parte di LRRK2 G2019S ed hanno evidenziato un nuovo meccanismo regolatorio che potrebbe essere compromesso nella malattia di Parkinson. In aggiunta, abbiamo trovato che Rab7L1 è un altro substrato dell’attività chinasica di LRRK2. Studi futuri sono necessari per scoprire se NSF e Rab7L1 siano substrati di LRRK2 anche in un contesto cellulare, e se la fosforilazione in condizioni patologiche è rilevante nel morbo di Parkinson.