Mechanisms underlying the increased susceptibility to cortical spreading depression in a mouse model of familial hemiplegic migraine type 2

L’emicrania emiplegica familiare di tipo 2 (FHM2) è un sottotipo di emicrania con aura, causata da una mutazione con perdita di funzione nel gene ATP1A2, codificante per la subunità alpha2 della Na+,K+ATPase (alpha2NKA). La alpha2 NKA è espressa quasi esclusivamente negli astrociti nel cervello adulto. Nel cervello dei topi eterozigoti in cui è stata inserita la mutazione umana W887R che causa l’FHM2 (FHM2-KI), i livelli di espressione della proteina alpha2 NKA sono dimezzati rispetto ai topi wild-type (WT). I topi FHM2-KI hanno una ridotta soglia di innesco e un’aumentata velocità di propagazione della cortical spreading depression (CSD), il fenomeno alla base dell’aura emicranica. Lo scopo del mio dottorato è stato studiare i meccanismi alla base della facilitazione della CSD in un modello murino di FHM2. Data la colocalizzazione della alpha2 NKA con i trasportatori gliali del glutammato (GluTs) nei processi astrocitari delle sinapsi eccitatorie, l’ipotesi è che la rimozione del glutammato negli FHM2-KI sia compromessa e che questo comporti un’aumentata neurotrasmissione glutammatergica, e quindi la facilitazione della CSD. Attraverso la misura della corrente attivata sinapticamente mediata dai trasportatori del glutammato (GluTs), è stato dimostrato che la ridotta espressione della alpha2 NKA comporta una ridotta ricaptazione del glutammato negli FHM2-KI. E’ stato dimostrato che, in vitro, la CSD sperimentale è facilitata negli FHM2-KI rispetto ai WT. Ho studiato se vi fosse una relazione causa-effetto tra la ridotta rimozione del glutammato e la facilitazione della CSD negli FHM2-KI, mediante due diversi approcci: nel primo ho testato l’effetto del Ceftrixone (Cef), un farmaco che aumenta l’espressione in membrana dei GLT-1 nella neocorteccia, sul ripristino di soglia e velocità di propagazione della CSD degli FHM2-KI ai valori dei WT. Il trattamento farmacologico degli FHM2-KI con Cef aumenta significativamente la soglia per l’innesco, senza influenzare la velocità di propagazione della CSD. Con il secondo approccio ho testato se la riduzione farmacologica della rimozione del glutammato nei WT, in misura simile agli FHM2-KI, abbassasse la soglia per l’innesco della CSD e ne aumentasse la velocità di propagazione come nella mutazione. Ho identificato la concentrazione di un inibitore dei GluTs capace di mimare l’effetto della mutazione ed ho trovato che questa concentrazione abbassa la soglia per l’innesco della CSD in modo simile agli FHM2-KI e aumenta la velocità di propagazione anche se in maniera inferiore rispetto agli FHM2-KI, suggerendo che la ridotta rimozione del glutammato rende conto della maggior parte della facilitazione dell’induzione e di parte della velocità di propagazione. Dato il ruolo dei recettori N-methyl-D-aspartate (NMDARs) nell’innesco della CSD, ho studiato se negli FHM2-KI vi fosse un aumentata attivazione degli NMDARs dovuta allo spillover del glutammato. La misura della corrente postsinaptica eccitatoria mediata dagli NMDARs (NMDARs-EPSC) evocata nei neuroni piramidali dello strato 2/3 della corteccia somatosensoriale mediante stimolazione extracellulare nello strato 1 in fettina di cervello, ha dimostrato che l’ampiezza è aumentata ed il tempo di decadimento rallentato negli FHM2-KI rispetto ai WT. Ho studiato il profilo farmacologico degli NMDARs attivati dallo spillover del glutammato. Ho trovato che nei topi WT, la maggior parte dell’NMDARs-EPSC è dovuto all’attivazione dei recettori trieteromerici GluN2A-2B (GluN2A-2BRs) e solo una piccola parte ai dieteromerici GluN2B (GluN2BRs), mentre negli FHM2-KI una frazione maggiore dell’NMDARs-EPSC è dovuta ai GluN2BRs. Questo è consistente con un reclutamento preferenziale dei GluN2BRs dall’aumentato spillover del glutammato. Il confronto dei dati farmacologici suggerisce che l’aumentata attivazione dei GluN2BRs potrebbe quantitativamente rendere conto della maggior parte, se non completamente, dell’aumentata attivazione degli NMDARs negli FHM2-KI rispetto ai WT. Questi dati negli FHM2 e dati precedenti ottenuti nei topi FHM1 KI, supportano l’idea che un’eccessiva neurotrasmissione glutammatergica ed un’eccessiva attivazione dei recettori NMDA abbiano un ruolo fondamentale nella facilitazione della CSD nei modelli di FHM. Precedenti studi in laboratorio hanno rivelato un’inalterata neurotrasmissione inibitoria a diverse sinapsi inibitorie in contrasto con un’aumentata trasmissione eccitatoria alle sinapsi corticali ed, assieme con l’espressione della alpha2 NKA alle sinapsi corticali eccitatorie ma non inibitorie, suggeriscono una regolazione disfunzionale del bilanciamento eccitazione/inibizione nei topi FHM. Per testare questa ipotesi abbiamo deciso di studiare se le mutazioni che causano l’FHM alterino la regolazione eccitazione/inibizione nello strato 2/3 della corteccia somatosensoriale durante l’attività di network ricorrente indotta da attivazione optogenetica delle cellule piramidali dello strato 2/3, con tipi differenti stimoli luminosi, che mimano differenti tipologie di attività fisiologiche. Attraverso la tecnica dell’elettroporazione in utero abbiamo cercato di esprimere selettivamente la channelrhodopsin-2, un canale cationico non-specifico che si depolarizza in seguito ad illuminazione con luce blu (443 nm), nelle cellule piramidali dello strato 2/3. Questo permette di attivare selettivamente cellule piramidali dello strato 2/3 in fettine di cervello talamo-corticali e registrare correnti eccitatorie ed inibitorie evocate dagli stimoli luminosi in neuroni piramidali che non esprimono channelrhodopsin-2. Nell’ultimo periodo mi sono occupata di implementare questa tecnica in particolare migliorando I) la concentrazione di cDNA e Fast Green FCF da iniettare negli embrioni; II) i parametri di elettroporazione ed iniezione; III) le strategie di accoppiamento per ottenere un maggior numero di topi incinta e di cuccioli che sopravvivono all’intera procedura. Se riusciremo a risolvere gli ultimi problemi tecnici relativi alla tecnica dell’elettroporazione in utero siamo pronti a studiare se le mutazioni FHM alterino la regolazione dinamica del bilanciamento eccitazione/inibizione nello strato 2/3 durante l’attività ricorrente di network.