Contributo alla determinazione degli anticorpi anticardiolipina e anti - beta2 glicoproteina I

Introduzione. Gli anticorpi antifosfolipidi (aPL) sono un gruppo eterogeneo di autoanticorpi specifici per complessi fosfolipide-proteina o proteine leganti i fosfolipidi. La loro presenza in pazienti con trombosi e/o complicanze ostetriche definisce la sindrome da anticorpi antifosfolipidi (APS). L'APS viene considerata primaria (PAPS) se presente in forma isolata, altrimenti secondaria se associata ad altra malattia autoimmune sistemica che solitamente e' il lupus eritematosus sistemico (LES). I criteri di laboratorio per la classificazione di APS includono la presenza di tre aPL ed in particolare del lupus anticoagulant (LA) e/o di livelli medio-alti di anticorpi anticardiolipina (aCL) IgG/IgM e/o di livelli medio-alti di anticorpi anti-Beta2glycoproteina I (anti-Beta2GPI) IgG/IgM, tutti confermati non prima di 12 settimane. Attualmente, le metodiche ELISA per la determinazione degli aCL e anti-Beta2GPI di classe IgG/IgM, nonostante svariati tentativi, non sono ancora standardizzate. Di recente, alcuni studi hanno confrontato le performance dei test ELISA con quelle di altre tecnologie anche completamente automatizzate tra le quali rientrano sia il fluorescence enzyme immunoassay (FEIA) che il chemiluminescence immunoassay (CLIA). Questi lavori, tuttavia, hanno prodotto risultati non concordanti. Gli anticorpi aCL e anti-Beta2GPI di classe IgA non sono ancora considerati criterio di laboratorio per la classificazione dell'APS e la loro rilevanza clinica e' al momento oggetto di dibattito. Inoltre gli aPL non sono considerati soltanto strumenti di classificazione dell'APS, ma anche parametri per la stratificazione del rischio di sviluppare le manifestazioni cliniche della malattia. In particolare, gli anticorpi anti-Beta2GPI specifici per un preciso epitopo situato nel Dominio I della molecola sembrano essere associati maggiormente al rischio di trombosi piuttosto che all'impegno ostetrico e di conseguenza sarebbero correlati a un quadro clinico piu' severo dell'APS. Obiettivi. Lo scopo della tesi e' stato di confrontare la performance di un ELISA home made con quella delle tecniche FEIA e CLIA nel rilevamento degli anticorpi aCL IgG/IgM e anti-Beta2GPI IgG/IgM in un'ampia e omogenea coorte di pazienti affetti da sindrome da anticorpi antifosfolipidi primaria (PAPS) e in un gruppo di soggetti con i criteri clinici per la classificazione di APS ma ELISA negativi per i criteri di laboratorio. I risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti in un gruppo di controllo comprendente donatori sani e pazienti con malattie autoimmuni diverse dall'APS. Successivamente e' stata valutata la rilevanza clinica degli aCL e anti-Beta2GPI di classe IgA e degli anticorpi anti-Dominio I (anti-DI) di isotipo IgG in un'ampia ed omogenea coorte di pazienti affetti esclusivamente da PAPS. Inoltre, la sensibilita'  diagnostica di questi anticorpi e' stata valutata in un gruppo di pazienti sieronegativi per gli aPL convenzionali, ma con manifestazioni cliniche di APS. Di entrambi gli anticorpi e' stato anche indagato il valore prognostico nell'ambito dell'APS. Metodi. Gli aCL e gli anti-Beta2GPI di classe IgG/IgM/IgA sono stati determinati usando il metodo FEIA (EliA TM, Phadia AB, Sweden). Inoltre gli aCL e anti-Beta2GPI di classe IgG/IgM sono stati anche analizzati assieme gli anticorpi anti-DI IgG utilizzando il metodo CLIA (HemosIL AcuStar®). Le raccomandazioni del produttore sono state seguite scrupolosamente per entrambe le tecniche. Per il confronto dei risultati ottenuti con le diverse metodiche e' stato usato un test ELISA home made, eseguito seguendo le raccomandazioni del Forum europeo sugli aPL. Tutti i sieri sono stati testati anche per LA seguendo le linee guida aggiornate utilizzando il tempo di veleno di vipera Russell ed il tempo di protrombina parziale attivata, entrambi con fosfolipidi diluiti, come tests di screening. Risultati e Conclusioni. (1) Confronto ELISA home made con FEIA. Le sensibilita'  delle tecniche ELISA home made e FEIA sono risultate essere simili ad eccezione degli aCL di classe IgM che sono risultati significativamente piu' frequenti nei pazienti PAPS con il metodo ELISA. I due metodi avevano una specificita' simile, un'elevata concordanza e una correlazione significativa tra i livelli anticorpali. Inoltre il metodo FEIA non ha rilevato alcuna significativa prevalenza degli anticorpi antifosfolipidi nei pazienti ELISA negativi, ma con manifestazioni cliniche di APS. In conclusione, questi risultati suggeriscono che il metodo FEIA e' paragonabile al test ELISA home made. Se confermato da altri studi su ampie casistiche di pazienti affetti da PAPS, questi risultati potrebbero supportare l'uso del FEIA nella determinazione degli aCL e anti-Beta2GPI nell'analisi di routine. Risultati e Conclusioni. (2) Confronto ELISA home made con CLIA. Quando e' stata confrontata la tecnica ELISA home made con la tecnica CLIA, e' emerso che il metodo CLIA aveva una sensibilita' significativamente piu' bassa per gli aCL IgM e gli anti-Beta2GPI IgG/IgM rispetto a quella dell'ELISA; invece la sua specificita' e' risultata significativamente piu' alta per gli anticorpi aCL IgM e anti-Beta2GPI IgM. Le due tecniche hanno mostrato un'alta e significativa concordanza e una significativa correlazione dei titoli anticorpali. Inoltre il CLIA ha rilevato gli anticorpi aCL IgG/IgM e anti-Beta2GPI IgG nei pazienti sieronegativi in ELISA. Vi era infatti una prevalenza di aCL IgG e di anti-Beta2GPI IgG significativamente maggiore nei pazienti sieronegativi con i criteri clinici di APS che nella popolazione sana di controllo. In conclusione, il metodo CLIA, nonostante una minore sensibilita', ha mostrato una specificita' piu' alta per alcuni aPL e un buon livello di concordanza e di correlazione con la metodica ELISA home made. Il CLIA, inoltre, e' stato in grado di rilevare gli aCL IgG e gli anti-Beta2GPI IgG nei pazienti sieronegativi non identificati dall'ELISA. Se confermato da ulteriori studi, il CLIA potrebbe essere considerato un metodo valido per la valutazione di pazienti con manifestazioni cliniche di APS, ma con gli aPL negativi al test ELISA home made. Risultati e Conclusioni. (3) Gli aCl e gli anti-Beta2GPI di classe IgA: Gli aCL e gli anti-Beta2GPI di classe IgA sono stati testati con il metodo FEIA e sono risultati sgnificativamente presenti rispettivamente nel 19% e nel 50% dei pazienti affetti da PAPS. I loro titoli medi erano piu' elevati nei pazienti con impegno trombotico rispetto alle pazienti con impegno ostetrico. Tuttavia solo gli anti-Beta2GPI IgA erano significativamente associati alla trombosi. Quando sono stati analizzati i pazienti FEIA negativi per aCL IgG/IgM e per anti-Beta2GPI IgG/IgM ma con le caratteristiche cliniche di APS, nel 10,6% di essi sono stati trovati gli anticorpi anti-Beta2GPI IgA. Questo dato e' risultato essere significativo nel confronto con la popolazione sana di controllo. In conclusione, la positivita' per gli anticorpi anti-Beta2GPI IgA definita con il metodo FEIA e' risultata clinicamente rilevante nei pazienti PAPS. Inoltre la presenza di anticorpi anti-Beta2GPI IgA era significativa nei pazienti sieronegativi per gli isotipi IgG e IgM. Questi risultati suggeriscono che nei pazienti con segni/sintomi clinici di APS, ma che non soddisfano i criteri di laboratorio per gli anticorpi antifosfolipidi convenzionali si potrebbero determinare gli anticorpi anti-Beta2GPI di classe IgA al fine di incrementare la sensibilita'  diagnostica per APS. Risultati e Conclusioni. (4) Gli anti-DI IgG: La sensibilita' e la specificita' degli anticorpi anti-DI IgG rilevati con il metodo CLIA erano paragonabili a quelle degli anticorpi aCL IgG e anti-Beta2GPI IgG. Si e' riscontrata una significativa concordanza, un'associazione e una correlazione dei titoli anticorpali degli anti-DI IgG con gli aCL IgG e gli anti-Beta2GPI IgG. Inoltre gli anticorpi anti-DI IgG hanno mostrato una minore prevalenza e titoli medi piu' bassi nelle complicanze ostetriche rispetto ai pazienti con trombosi e ai pazienti con entrambi i coinvolgimenti clinici. Per quanto riguarda i profili anticorpali degli aPL convenzionali, il gruppo con la triplice positivita' antifosfolipidica ha mostrato una maggiore prevalenza e maggior titoli medi degli anticorpi anti-DI, rispetto ai gruppi con singola e duplice positivita'. In conclusione, gli anti-DI, rilevati con la tecnica CLIA, possono essere considerati dei promettenti biomarkers per la valutazione del rischio clinico di trombosi vascolare e di triplice positivita' per gli aPL convenzionali, solitamente associata ai quadri clinici piu' severi di APS. Pertanto, essi possono costituire uno strumento aggiuntivo utile per eventuali decisioni cliniche e terapeutiche.