Identification of functional miRNA interactions in Malignant Melanoma progression

Il Melanoma è una delle forme più aggressive di tumore cutaneo. Pur rappresentando soltanto il 4% dei tumori della pelle causa quasi il 74% dei decessi dei pazienti che presentano neoplasie cutanee. Lo sviluppo di metastasi e la mancanza di terapie efficaci sono la causa di una mortalità così elevata. Recentemente, grazie a metodiche di medicina molecolare, i ricercatori hanno cercato di capire i meccanismi che portano allo sviluppo della massa tumorale e delle metastasi individuando nei microRNA (miRNA) dei possibili regolatori coinvolti nella progressione tumorale del Melanoma. Questi corti trascritti non codificanti hanno la capacità di regolare l’espressione di molti mRNA degradandoli o bloccandone la traduzione. Il processo di regolazione guidato dai miRNA è basato sul legame degli stessi a specifiche sequenze presenti nei trascritti target grazie all’ausilio di un complesso proteico formato prevalentemente dalle proteine della famiglia Argonaute (AGO). Lo scopo di questa tesi è di identificare queste interazioni miRNA-mRNA coinvolte nelle vie di segnale che controllano lo sviluppo di metastasi nel Melanoma. Gli esperimenti presentati in questo lavoro sono stati effettuati sfruttando un modello cellulare che mima lo sviluppo metastatico (Xu et al., 2008). Il sistema vede l’utilizzo di una linea cellulare a basso potenziale metastatico (LMC), delle linee cellulari derivate dalla stessa ma con maggiore potenziale metastatico (HMC) e delle metastasi polmonari originate dall’iniezione di queste linee cellulari in topi immuno-deficienti. Per raggiungere lo scopo di questa tesi ho messo a punto due approcci che mirano al raggiungimento del medesimo risultato permettendo così anche di validare gli stessi. Il primo approccio, prettamente di tipo bioinformatico, sfrutta i dati di espressione dei miRNA e degli mRNA ottenuti da esperimenti di microarray per individuare le coppie miRNA-mRNA coinvolte nello sviluppo del Melanoma. Il secondo approccio, invece, si basa su una nuova metodica (AGO-Hits-CLIP) per l’identificazione genome-wide di interazioni miRNA-mRNA. Questa metodica sfrutta l’immunoprecipitazione delle proteine AGO e il recupero delle molecole di RNA ad esse associate (in questo caso i miRNA e i messaggeri bersaglio a cui erano legati). Successivamente, l’RNA precipitato viene sequenziato per permetterne l’identificazione. L’integrazione dei dati ottenuti dall’analisi con i microarray (meta-analisi) e dall’AGO-Hits-CLIP mi hanno permesso di individuare delle interazioni miRNA-bersaglio coinvolte nello sviluppo di metastasi generate dal Melanoma. Innanzitutto mi ha permesso di individuare una serie di vie di segnale strettamente correlate all’extravasazione delle cellule dal torrente circolatorio. Queste vie sono probabilmente regolate da alcuni membri di un cluster policistronico di miRNA: il miR-106a~363. In particolare grazie alla metodica AGO-Hits-CLIP ho validato due interazioni del miR-106; una con il trascritto WAVE3 e l’altra con VEGFA. Questi sono rispettivamente coinvolti nella formazione delle protrusioni che la cellula utilizza per invadere i tessuti (l’invadopodium) e nella permeabilizzazione della parete dei vasi sanguigni,. Inoltre è stata confermata l’importanza del miR-214 e di let-7c nello sviluppo metastatico. L’effetto di miR-214 è stato confermato anche dagli studi di una nostra collaboratrice, la Professoressa Daniela Taverna dell’Università di Torino mentre per let-7c ho validato due interattori (FNDC3B e FOXN) identificati mediante la metodica AGO-Hits-CLIP. Oltre alla relazione miRNA:mRNA, la tecnica AGO-Hits-CLIP ha permesso di evidenziare una nuova classe di interattori: i lncRNA. Questi sono dei trascritti non codificanti lunghi più di 200 nt che sembrano funzionare da “spugna” per i microRNA, sequestrandoli e impedendone la loro funzione regolativa. Concludendo, i risultati ottenuti sostengono l’importanza dei miRNA nello sviluppo del Melanoma e nella sua metastatizzazione evidenziandone il ruolo cardine per un futuro sviluppo di nuovi farmaci che consentano la riduzione del rischio di sviluppare metastasi e, di conseguenza, di diminuire l’alta mortalità.