Investigating the role of the Roc/GTPase domain of the Parkinson's disease kinase LRRK2 in regulating protein function and activity

La malattia di Parkinson (MP) è la seconda malattia neurodegenerativa più comune dell’era moderna. Nonostante un’eziologia incerta, il 10% dei pazienti soffre di una forma monogenica di MP. Mutazioni nel gene Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) sono la causa più comune di MP autosomica dominante ad insorgenza tardiva e aumentano il rischio di sviluppare la MP. LRRK2 possiede una duplice attività enzimatica: GTPasica nel dominio Roc e chinasica, collegate da un dominio COR. Date la robusta associazione con la MP e la presenza di un’attività chinasica modulabile dal punto di vista farmacologico, sono stati compiuti notevoli sforzi per esplorare il ruolo fisiopatologico di LRRK2. L’attuale comprensione della biologia di LRRK2 proviene dallo studio di modelli knockout o dalla manipolazione dell’attività chinasica, dato che la mutazione patologica più comune è la G2019S nel dominio chinasico e l’attività chinasica è associata ad aumentata tossicità cellulare. Al contrario, Roc ha ricevuto minore attenzione, probabilmente a seguito delle difficoltà nel misurare l’attività GTPasica in vitro. Tuttavia, l’interazione tra i due moduli enzimatici e le proprietà di signalling di Roc rendono il dominio GTPasico un elemento chiave nel determinare le proprietà biochimiche e cellulari di LRRK2. Una caratterizzazione completa dei meccanismi intramolecolari di regolazione e delle cascate di segnale orchestrate dal dominio chinasico è dunque un requisito essenziale per individuare strategie terapeutiche alternative qualora l’inibizione dell’attività chinasica fosse mal tollerata o inefficace. Questo progetto si è focalizzato su una caratterizzazione globale del ruolo di Roc nel regolare le proprietà biochimiche di LRRK2 ed il legame con un interattore precedentemente identificato, p21-activated kinase 6 (PAK6). A livello funzionale, sono stati investigati due processi associati a LRRK2 in modo convincente: autofagia e rimodellamento dei neuriti. Più precisamente, abbiamo caratterizzato un modello cellulare murino, in cui Lrrk2 endogena è stata ingegnerizzata geneticamente per impedire il legame dei nucleotidi guaninici, in termini di stabilità della proteina, autofagia basale e capacità di rispondere a stimoli autofagici. Abbiamo osservato che l’assenza di legame coi nucleotidi nel Roc influenza i livelli di Lrrk2 e la risposta all’induzione del flusso autofagico. La seconda parte dello studio riguarda la caratterizzazione dell’interazione LRRK2-PAK6. PAK6 regola le dinamiche del citoscheletro di actina. Il nostro gruppo ha dimostrato che PAK6 interagisce con Roc e promuove la crescita dei neuriti in vivo grazie alla sua attività chinasica in dipendenza da LRRK2 e dal GTP. Di recente, abbiamo dimostrato che le due proteine esercitano una vicendevole modulazione e la sovra-espressione di PAK6 può recuperare i difetti nella crescita dei neuriti associati alla mutazione G2019S in LRRK2. Abbiamo quindi fatto un passo ulteriore e, in collaborazione con il Dr. Patrick Lewis all’Università di Reading, abbiamo valutato l’impatto dell’inibizione farmacologica di PAK6 sull’autofagia, visto il ruolo assodato di LRRK2 e l’importanza del citoscheletro di actina nel processo, così come il coinvolgimento dell’omologo di PAK6, PAK1, nel promuovere l’autofagia tramite l’asse AKT/mTOR/ULK1. I nostri risultati mostrano chiare alterazioni nei markers autofagici analizzati a seguito del trattamento con un inibitore dell’attività chinasica di PAK6. Abbiamo poi caratterizzato gli effetti di una sostituzione de novo in PAK6 in termini di attività chinasica, localizzazione, sviluppo dei neuriti ed interazione con LRRK2, e le conseguenze di una mutazione patologica nel Roc in termini di legame con PAK6. Mentre la variante di PAK6 non influenza le proprietà della proteina, la mutazione nel Roc riduce l’interazione con PAK6. Globalmente, i nostri dati suggeriscono che qualunque alterazione di Roc abbia severe conseguenze per i livelli basali di LRRK2, l’attività della proteina ed il legame con gli interattori, con un probabile impatto sulla localizzazione subcellulare e le cascate di segnale a valle.