Il linfoma anaplastico a grandi cellule (ALCL) è un sottotipo di linfoma non-Hodgkin (LNH) aggressivo prevalentemente a fenotipo T e rappresenta circa il 3% dei LNH dell’adulto e il 10-15% dei linfomi pediatrici. Nella maggioranza dei casi, l’ALCL è associato alla presenza di traslocazioni cromosomiche che coinvolgono il gene della chinasi ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase), la più frequente delle quali è la t(2;5)(p23;q35), che determina l’espressione aberrante della chinasi di fusione NPM-ALK, costitutivamente attiva. È stato ampiamente dimostrato che l’espressione aberrante di NPM-ALK contribuisce alla patogenesi dell’ALCL, esercitando la sua attività trasformante mediante l’attivazione di numerosi vie di trasduzione del segnale connesse alla proliferazione, al controllo del ciclo cellulare e all’apoptosi. Sebbene gli ALCL che esprimono ALK siano caratterizzati da una prognosi piuttosto favorevole, quando trattati secondo i protocolli terapeutici standard, la percentuale di fallimento di questo tipo di terapie si attesta comunque intorno al 30%. Inoltre, la maggior parte delle recidive si verifica entro un anno dall’inizio del trattamento e la sopravvivenza dei pazienti recidivati non raggiunge il 50%. La deregolazione di ALK rappresenta uno degli eventi oncogenici più importanti non soltanto nel ALCL, ma anche nel neuroblastoma, nel tumore a piccole cellule del polmone (NSCLC) e nel tumore miofibroblastico infiammatorio (IMT) che presentano mutazioni o riarrangiamenti del gene ALK. Studi in vitro ed in vivo hanno dimostrato che l’inibizione dell’attività chinasica di ALK riduce in modo significativo la proliferazione e l’invasività delle cellule tumorali. Inoltre, l’inibitore di ALK crizotinib si è dimostrato molto efficace per il trattamento di pazienti affetti da NSCLC, ad ulteriore dimostrazione che l’inibizione dell’attività catalitica di questa proteina potrebbe rappresentare una strategia terapeutica promettente anche nell’ALCL ALK-positivo, così come in altri tumori associati ad espressione aberrante di ALK. Tuttavia, analogamente a quanto è stato osservato con altri inibitori di tirosin chinasi oncogene, alcuni pazienti in corso di trattamento con crizotinib sono recidivati in seguito all’insorgenza di mutazioni a carico della chinasi bersaglio. In questo contesto, sebbene una terapia di questo tipo possa essere estremamente efficace per il trattamento dell’ALCL, è necessario tenere presente che alcuni pazienti potrebbero sviluppare resistenza. Risulta quindi di fondamentale importanza conoscere lo stato mutazionale del dominio chinasico di NPM-ALK per poter pianificare una strategia terapeutica il più possibile efficace. Allo scopo di identificare mutazioni somatiche di NPM-ALK potenzialmente associate alla risposta al trattamento in pazienti con ALCL ALK-positivo, abbiamo sequenziato gli esoni 22-25 di NPM-ALK, corrispondenti all’intero dominio chinasico, in 37 pazienti con ALCL pediatrico, utilizzando un approccio di Next-Generation sequencing. In due pazienti distinti abbiamo identificato due mutazioni puntiformi a bassa frequenza, corrispondenti alle sostituzioni aminoacidiche R1275Q e R1231Q. La prima mutazione era già stata riportata nel neuroblastoma tra le più frequenti mutazioni attivanti, mentre la mutazione R1231Q non era nota né per ALK recettore, né in tumori in cui ALK è traslocato. Le implicazioni molecolari di queste mutazioni sull’attività di NPM-ALK e sulla sua sensibilità al trattamento con inibitori specifici sono oggetto di ulteriori studi in corso. Oltre alle mutazioni puntiformi, la presenza di trascritti derivanti da fenomeni di splicing alternativo è un fenomeno già noto per altre protein chinasi di fusione, come Bcr-Abl nella leucemia mieloide cronica, ma anche in ALK in pazienti affetti da neuroblastoma. Sulla base delle nostre conoscenze, tali fenomeni, tuttavia, non sono mai stati descritti per NPM-ALK. Per la prima volta, abbiamo identificato e caratterizzato 9 mutazioni INDEL di NPM-ALK, associate alla perdita di interi esoni o al riconoscimento di siti di splicing canonici alternativi. Allo scopo di comprendere quali potessero essere gli effetti di queste mutazioni sull’attività di NPM-ALK, abbiamo condotto delle analisi di molecular homology modelling e studi funzionali in vitro. Sebbene tutti questi mutanti siano risultati inattivi, abbiamo dimostrato che se vengono coespressi assieme alla loro controparte funzionale sono in grado di formare dei complessi con essa, riducendone l’attività catalitica e aumentando la sensibilità della chinasi al trattamento con crizotinib. Questo lavoro di tesi dimostra che mutazioni puntiformi del dominio chinasico di NPM-ALK sono piuttosto rare nei pazienti con ALCL prima dell’inizio della terapia, anche se una selezione positiva delle cellule con la mutazione potrebbe verificarsi nel caso in cui venisse utilizzato un trattamento a base di inibitori specifici di ALK. Al contrario, abbiamo dimostrato che gli eventi di splicing alternativo di NPM-ALK sono maggiormente frequenti, anche se non è stato possibile dimostrare una correlazione tra la presenza di queste varianti e il decorso della malattia, probabilmente a causa della bassa numerosità della nostra casistica. Tuttavia, riteniamo che queste mutazioni potrebbero avere un impatto significativo nel caso in cui i pazienti venissero trattati con inibitori specifici di ALK. In particolare, pazienti che esprimono livelli rilevanti di isoforme inattive di NPM-ALK potrebbero rispondere diversamente al trattamento. Resta da stabilire se questa differenza possa tradursi in una maggiore o minore efficacia di una terapia anti-ALK in questi pazienti.
Ultra-deep mutational analysis of NPM-ALK and possible implications on target therapy in anaplastic large cell lymphoma of childhood
LOVISA, FEDERICA
2013
Abstract
Il linfoma anaplastico a grandi cellule (ALCL) è un sottotipo di linfoma non-Hodgkin (LNH) aggressivo prevalentemente a fenotipo T e rappresenta circa il 3% dei LNH dell’adulto e il 10-15% dei linfomi pediatrici. Nella maggioranza dei casi, l’ALCL è associato alla presenza di traslocazioni cromosomiche che coinvolgono il gene della chinasi ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase), la più frequente delle quali è la t(2;5)(p23;q35), che determina l’espressione aberrante della chinasi di fusione NPM-ALK, costitutivamente attiva. È stato ampiamente dimostrato che l’espressione aberrante di NPM-ALK contribuisce alla patogenesi dell’ALCL, esercitando la sua attività trasformante mediante l’attivazione di numerosi vie di trasduzione del segnale connesse alla proliferazione, al controllo del ciclo cellulare e all’apoptosi. Sebbene gli ALCL che esprimono ALK siano caratterizzati da una prognosi piuttosto favorevole, quando trattati secondo i protocolli terapeutici standard, la percentuale di fallimento di questo tipo di terapie si attesta comunque intorno al 30%. Inoltre, la maggior parte delle recidive si verifica entro un anno dall’inizio del trattamento e la sopravvivenza dei pazienti recidivati non raggiunge il 50%. La deregolazione di ALK rappresenta uno degli eventi oncogenici più importanti non soltanto nel ALCL, ma anche nel neuroblastoma, nel tumore a piccole cellule del polmone (NSCLC) e nel tumore miofibroblastico infiammatorio (IMT) che presentano mutazioni o riarrangiamenti del gene ALK. Studi in vitro ed in vivo hanno dimostrato che l’inibizione dell’attività chinasica di ALK riduce in modo significativo la proliferazione e l’invasività delle cellule tumorali. Inoltre, l’inibitore di ALK crizotinib si è dimostrato molto efficace per il trattamento di pazienti affetti da NSCLC, ad ulteriore dimostrazione che l’inibizione dell’attività catalitica di questa proteina potrebbe rappresentare una strategia terapeutica promettente anche nell’ALCL ALK-positivo, così come in altri tumori associati ad espressione aberrante di ALK. Tuttavia, analogamente a quanto è stato osservato con altri inibitori di tirosin chinasi oncogene, alcuni pazienti in corso di trattamento con crizotinib sono recidivati in seguito all’insorgenza di mutazioni a carico della chinasi bersaglio. In questo contesto, sebbene una terapia di questo tipo possa essere estremamente efficace per il trattamento dell’ALCL, è necessario tenere presente che alcuni pazienti potrebbero sviluppare resistenza. Risulta quindi di fondamentale importanza conoscere lo stato mutazionale del dominio chinasico di NPM-ALK per poter pianificare una strategia terapeutica il più possibile efficace. Allo scopo di identificare mutazioni somatiche di NPM-ALK potenzialmente associate alla risposta al trattamento in pazienti con ALCL ALK-positivo, abbiamo sequenziato gli esoni 22-25 di NPM-ALK, corrispondenti all’intero dominio chinasico, in 37 pazienti con ALCL pediatrico, utilizzando un approccio di Next-Generation sequencing. In due pazienti distinti abbiamo identificato due mutazioni puntiformi a bassa frequenza, corrispondenti alle sostituzioni aminoacidiche R1275Q e R1231Q. La prima mutazione era già stata riportata nel neuroblastoma tra le più frequenti mutazioni attivanti, mentre la mutazione R1231Q non era nota né per ALK recettore, né in tumori in cui ALK è traslocato. Le implicazioni molecolari di queste mutazioni sull’attività di NPM-ALK e sulla sua sensibilità al trattamento con inibitori specifici sono oggetto di ulteriori studi in corso. Oltre alle mutazioni puntiformi, la presenza di trascritti derivanti da fenomeni di splicing alternativo è un fenomeno già noto per altre protein chinasi di fusione, come Bcr-Abl nella leucemia mieloide cronica, ma anche in ALK in pazienti affetti da neuroblastoma. Sulla base delle nostre conoscenze, tali fenomeni, tuttavia, non sono mai stati descritti per NPM-ALK. Per la prima volta, abbiamo identificato e caratterizzato 9 mutazioni INDEL di NPM-ALK, associate alla perdita di interi esoni o al riconoscimento di siti di splicing canonici alternativi. Allo scopo di comprendere quali potessero essere gli effetti di queste mutazioni sull’attività di NPM-ALK, abbiamo condotto delle analisi di molecular homology modelling e studi funzionali in vitro. Sebbene tutti questi mutanti siano risultati inattivi, abbiamo dimostrato che se vengono coespressi assieme alla loro controparte funzionale sono in grado di formare dei complessi con essa, riducendone l’attività catalitica e aumentando la sensibilità della chinasi al trattamento con crizotinib. Questo lavoro di tesi dimostra che mutazioni puntiformi del dominio chinasico di NPM-ALK sono piuttosto rare nei pazienti con ALCL prima dell’inizio della terapia, anche se una selezione positiva delle cellule con la mutazione potrebbe verificarsi nel caso in cui venisse utilizzato un trattamento a base di inibitori specifici di ALK. Al contrario, abbiamo dimostrato che gli eventi di splicing alternativo di NPM-ALK sono maggiormente frequenti, anche se non è stato possibile dimostrare una correlazione tra la presenza di queste varianti e il decorso della malattia, probabilmente a causa della bassa numerosità della nostra casistica. Tuttavia, riteniamo che queste mutazioni potrebbero avere un impatto significativo nel caso in cui i pazienti venissero trattati con inibitori specifici di ALK. In particolare, pazienti che esprimono livelli rilevanti di isoforme inattive di NPM-ALK potrebbero rispondere diversamente al trattamento. Resta da stabilire se questa differenza possa tradursi in una maggiore o minore efficacia di una terapia anti-ALK in questi pazienti.File | Dimensione | Formato | |
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https://hdl.handle.net/20.500.14242/83729
URN:NBN:IT:UNIPD-83729