RESEARCH OF PREDICTIVE AND PROGNOSTIC TISSUE AND MOLECULAR MARKERS AND OF NEW THERAPEUTIC TARGETS IN MALIGNANT PLEURAL MESOTHELIOMA

BACKGROUND: Il mesotelioma pleurico maligno (MPM) è una neoplasia aggressiva con incidenza in aumento nei paesi industrializzati per la pregressa esposizione ad amianto e il lungo periodo di latenza tra l’esposizione e la comparsa dei sintomi. TRAIL (Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand) appartiene alla famiglia dei ligandi di morte apoptotica di TNF (tumor necrosis factor), ed è stato recentemente identificato come promettente agente antitumorale in considerazione della sua proprietà di uccidere le cellule tumorali, risparmiando le cellule normali. Evidenze contrastanti riportano la presenza di resistenza piuttosto che di sensibilità delle cellule di mesotelioma maligno all’apoptosi mediata da TRAIL. Sebbene l’apoptosi indotta da TRAIL (via estrinseca dell’apoptosi) sembra essere indipendente da p53, alcune cellule tumorali portatrici di p53 wild-type possono essere sensibilizzate alla morte da TRAIL attraverso l’attivazione di p53 (via intrinseca dell’apoptosi). Contrariamente alla maggior parte delle neoplasie, le cellule di mesotelioma pleurico esprimono più frequentemente p53 wild-type, e quindi la riattivazione di p53 potrebbe essere una strategia efficace per sensibilizzare le cellule di mesotelioma all’apoptosi mediata da TRAIL. Agenti in grado di danneggiare il DNA (chemioterapia, radioterapia) ed altri agenti in grado di “down-regolare” gli inibitori di p53, possono essere considerati come valide strategie per riattivare p53. Murine Double Minute 2 (MDM2) è un bersaglio dell’attività trascrizionale di p53: una volta attivata, MDM2 lega il dominio ammino-terminale di p53 e la conduce al processo di ubiquitilazione e successiva degradazione proteasomica. Negli anni recenti, molti ricercatori hanno studiato un possibile ruolo di MDM2 nella attivazione di marcatori di neoangiogenesi tumorale (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF; hypoxia inducible factor, HIF1alpha), pertanto MDM2 potrebbe rappresentare un promettente bersaglio per il trattamento antitumorale in considerazione della sua possibile duplice attività antiapoptotica e proangiogenetica. La prognosi infausta dei pazienti affetti, l’assenza di opzioni terapeutiche efficaci, in particolare di farmaci biologici, l’assenza di marcatori predittivi di risposta ai farmaci a bersaglio molecolare, e la scarsità di conoscenze sui meccanismi che sottendono al diverso comportamento biologico e clinico dei due principali sottotipi istologici (epitelioide versus non-epitelioide), costituiscono il razionale del presente studio. OBIETTIVI: Il primo obiettivo è stato valutare nuove opzioni terapeutiche attraverso studi preclinici in vitro ed in vivo con associazione di induttori della via estrinseca dell’apoptosi (rhApo2L/TRAIL) e induttori della via intrinseca dell’apoptosi che agiscono attraverso riattivazione di p53, come agenti danneggianti il DNA (carboplatino/pemetrexed) o inibitori del legame p53-MDM2 (nutlin3-RG7112). Secondariamente, lo studio si è proposto di ricercare l’espressione dei nuovi bersagli terapeutici (MDM2, HIF1alpha) nei campioni tumorali di pazienti affetti da mesotelioma maligno, e di valutarne la diversa espressione nei diversi sottotipi istologici. Inoltre, il progetto si è focalizzato sulla valutazione di alcuni parametri morfologici come infiammazione, necrosi ed indice proliferativo nei campioni tumorali dei diversi istotipi e sulla loro correlazione con MDM2 e HIF1alpha. Infine, sono state valutate le correlazioni tra dati molecolari e caratteristiche cliniche dei pazienti in studio. MATERIALI E METODI: l’attività antitumorale di rhApo2L/TRAIL (Amgen, Genentech) in associazione a chemioterapia (Carboplatino/Pemetrexed) o nutlin3-RG7112 (Roche) è stata valutata in diverse linee cellulari attraverso il saggio di Annessina V e delle caspasi, e in un modello di topo Severe Combined ImmunoDeficiency (SCID). I livelli di espressione di p53 sono stati analizzati attraverso western blot. I recettori di TRAIL sono stati rilevati attraverso citofluorimetria. Campioni tumorali fissati in formalina e inclusi in paraffina da pazienti chemonaive sono stati analizzati con immunoistochimica e valutando l’espressione di mRNA per MDM2 e HIF1alpha. L’indice proliferativo è stato quantificato mediante anticorpo monoclonale di Ki67. La presenza di infiammazione e necrosi è stata valutata su sezioni istologiche. Campioni di pleura normale da pazienti sottoposti a chirurgia toracica per patologia non oncologica sono stati utilizzati come controlli negativi. I dati clinici dei pazienti in studio sono stati raccolti un un database protetto da password: età, sesso, ECOG PS (Performance Status), score prognostico EORTC, stadio, trattamenti sistemici, chirurgia, radioterapia, prima progressione, data di ultimo follow-up e status (vivo/morto). RISULTATI: I risultati in vitro ed in vivo mostrano un significativo aumento di apoptosi in linee cellulari e riduzione di volume tumorale in modelli animali trattati con rhApo2L/TRAIL in associazione a chemioterapia o nutlin3-RG7112, confrontato ai singoli trattamenti. Tale effetto sinergico è correlato all’incremento di espressione dei recettori di TRAIL (DR4 e 5) conseguente alla riattivazione di p53 da chemioterapia o nutlin3-RG7112. Abbiamo poi valutato i livelli di espressione di MDM2 e del suo possibile target HIF1alpha in campioni tumorali di pazienti affetti da mesotelioma. I livelli di espressione di MDM2 e HIF1alpha erano significativamente più elevati nel sottotipo istologico sarcomatoide/bifasico (p=0.010 and p=0.007, respectively), ed è stata osservata una correlazione positiva tra i livelli di espressione di MDM2 e HIF1alpha (coefficiente di correlazione =0.533; p = 0.00626). Infine, l’indice proliferativo (Ki67) si è dimostrato significativamente più elevato nel sottotipo istologico sarcomatoide/bifasico rispetto a quello epitelioide (p=0.005) e significativamente più elevato nei campioni con iperespressione di MDM2 (p=0.008). Per quanto riguarda gli obiettivi esploratori del progetto, nessuna correlazione prognostica è stata osservata per alcun parametro clinico o patologico o per diversi livelli di espressione dei biomarcatori in studio, mentre è stata osservata una correlazione significativa tra i livelli di Ki67 e la sopravvivenza libera da progressione. I risultati di tale indagine esploratoria devono, comunque, essere considerati con cautela per la limitata dimensione campionaria, l’eterogeneità degli interventi terapeutici e l’insufficiente follow-up di alcuni pazienti. CONCLUSIONI: I risultati in vitro e in vivo di questo progetto di ricerca dimostrano che la riattivazione di p53 con chemioterapia o molecole inibitrici del legame p53-MDM2 rappresenta un’efficace strategia per sensibilizzare all’apoptosi mediata da TRAIL. Lo studio traslazionale ha invece confermato diverse caratteristiche biologiche e patologiche così come differenti livelli di espressione di nuovi bersagli terapeutici nei due sottotipi istologici di MPM. MDM2 e Ki67 possono essere considerati come importanti ausili diagnostici per una migliore caratterizzazione dell’istotipo e soprattutto per identificare i tumori a peggiore prognosi. Inoltre, MDM2 e HIF1alpha potrebbero rappresentare promettenti bersagli per il trattamento del mesotelioma pleurico maligno.