Analisi bioinformatica e molecolare di cheratine e proteine associate nell'epidermide di cheloni e lucertole

Il tegumento dei Rettili è molto particolare rispetto a quello degli altri Vertebrati in quanto è dotato di squame. Queste sono costituite da ispessimenti cornei dell’epidermide con una forma, estensione e grado di sovrapposizione variabile nei numerosi gruppi di Rettili a seconda dell’habitat in cui si sono adattati a vivere (Lillywhite e Maderson, 1982; Price, 1982; Irish et al., 1988). La componente proteica di questo peculiare epitelio è costituita principalmente da alfa-cheratine e beta-proteine associate alle cheratine o KAbetaPs, un tempo chiamate beta-cheratine a causa della presenza di foglietti beta e della capacità di formare filamenti. Le alfa-cheratine o citocheratine sono presenti in tutti i Vertebrati e sono proteine strutturali fibrose appartenenti alla famiglia dei filamenti intermedi. Esse costituiscono l’impalcatura e determinano quindi la forma dei cheratinociti, sono responsabili della resistenza degli epiteli contro forze meccaniche e di tensione. Sono dotate di un peso molecolare che si aggira attorno ai 40-70 kDa, presentano un dominio centrale ad alfa-elica conservato per l’assemblaggio dei filamenti stessi, ed estremità globulari variabili (Steinert e Freedberg, 1991; Fuchs e Weber, 1994). Le KAbetaPs sono invece proteine esclusive dell’epidermide e di annessi cutanei di Rettili e Uccelli, sono le responsabili della formazione di uno spesso e robusto strato corneo in quanto si associano alle alfa-cheratine negli strati pre-cornei e progressivamente le mascherano fino a sostituirle completamente negli strati cornei più esterni dell’epidermide. Le beta-proteine sono inestensibili e non pieghevoli. La rigidità è dovuta principalmente al loro contenuto in cisteina, amminoacido che permette la formazione di ponti disolfuro che formano legami crociati intra- ed intermolecolari. Il meccanismo di aggregazione delle beta-proteine non è ancora del tutto noto ma modelli di predizione della loro struttura proteica indicano che la porzione centrale della molecola costituita da 34 amminoacidi ad alta omologia, anche chiamata “core-box”, presenta una conformazione secondaria a foglietto beta (Fraser e Parry, 1996, 2011). Legami di interazione forte tra queste regioni beta sono ritenuti responsabili della formazione dei polimeri a partire dai monomeri di beta-proteina. I monomeri hanno basso peso molecolare, compreso tra i 10 e i 25 kDa, ridotta solubilità, dovuta presumibilmente ad una elevata quantità di glicina e un punto isoelettrico generalmente basico (Werlang e Brandelli, 2005). Il presente lavoro di tesi si è focalizzato sullo studio del ruolo svolto da alcuni tipi di alfa-cheratine e beta-proteine nell’influenzare il processo di corneificazione dell’epidermide in alcune specie di tartarughe e lucertole. La ricerca è stata suddivisa in tre filoni principali. Nel primo filone sono state prese in considerazione due specie di tartarughe dulcacquicole (A. spinifera, nota anche come tartaruga a guscio molle, e P. nelsonii, tartaruga a guscio duro) allo scopo di esaminare il ruolo di alcune citocheratine e beta-proteine associate nel conferire robustezza e durezza all’epidermide. In particolare A. spinifera è dotata di un tegumento non squamato che ha portato ad ipotizzare, nel tentativo di spiegare la consistenza soffice della cute, l’assenza di KAbetaPs o una loro modificazione nella regione del “core-box”. Tramite la costruzione di una libreria di cDNA a partire da mRNA estratto dai bordi del carapace della tartaruga a guscio molle sono state isolate e in seguito caratterizzate alcune sequenze codificanti alfa-cheratine e beta-proteine. Successive analisi bioinformatiche hanno evidenziato la presenza di una regione “core-box” molto ben conservata in tutte le KAbetaPs identificate. Anche se tali analisi hanno confutato le ipotesi iniziali, rimane però ancora da chiarire come mai queste proteine non riescano ad aggregarsi per formare i tipici filamenti densi presenti negli strati beta degli altri Rettili. Confrontando in seguito mediante Real-Time PCR assoluta l’espressione di alfa-cheratine e beta-proteine isolate in A. spinifera con i rispettivi putativi geni ortologhi presenti nella tartaruga a guscio duro P. nelsonii, si è rilevata una maggiore espressione di tutti i geni presi in considerazione nella tartaruga a guscio molle rispetto a quella a guscio duro. Questi risultati sono molto probabilmente imputabili non solo alla quantità e varietà di cheratine e proteine associate nelle due specie, ma anche a una diversa struttura e dinamica di rinnovo dell’epidermide: una maggiore velocità di ricambio cellulare che avviene per esfoliazione continua in A. spinifera contro una maggiore capacità di accumulo nel tempo di specifiche proteine dovuta a una muta periodica che avviene una volta all’anno in P. nelsonii. Dal momento che la coda di lucertola in rigenerazione rappresenta un buon modello sperimentale per lo studio della formazione e differenziazione degli strati cornei del tegumento dei Rettili, nel secondo filone di ricerca è stata inoltre analizzata e confrontata tramite Real-Time PCR assoluta l’espressione di alcune citocheratine (tipo I, acido, e II, basico) e di particolari beta-proteine nella coda normale e in rigenerazione della lucertola verde americana Anolis carolinensis. I risultati ottenuti hanno mostrato che i trascritti codificanti tali proteine sono maggiormente espressi nella coda in rigenerazione rispetto alla coda normale, fatto questo dovuto all’elevato tasso di differenziazione cellulare che si ha nel corso della rigenerazione delle squame, ma l’aspetto interessante è che ogni trascritto presenta un peculiare e diverso livello di espressione tra coda normale e coda in rigenerazione, a dimostrazione che i vari trascritti sono regolati in modo diverso a livello trascrizionale. Infine, il terzo filone di ricerca ha riguardato un primo approccio di studio del promotore genico che scatena la rapida sintesi di beta-proteine durante il rinnovo epidermico che porta alla muta. Si è svolta l’analisi bioinformatica della regione promotrice di tutte le 40 sequenze che codificano KAbetaPs isolate dal genoma completo dell’A. carolinensis (Dalla Valle et al., 2010), allo scopo di individuare possibili pattern di siti di legame per fattori di trascrizione. Lo studio ha individuato alcuni fattori generali sempre presenti, alcuni molto ricorrenti e numerosi fattori specifici. Restano ancora necessarie ulteriori analisi di tipo sperimentale per identificare i fattori di trascrizione implicati nella regolazione dell’espressione genica tessuto-specifica di queste proteine.