Inhibition of HCMV replication by small molecules interfering with the dimerization of the DNA polymerase processivity factor UL44

Cytomegalovirus (CMV) è un importante patogeno di interesse umano. Al momento gli antivirali disponibili ed utilizzati per la terapia contro l’infezione da CMV presentano una serie di problematica quali l’alto costo, bassa biodisponibilità, alta tossicità ed il presentarsi di ceppi virali resistenti. Inoltre non è disponibile un vaccino ed ancora non è stato approvato alcun farmaco per prevenire la trasmissione verticale durante la gravidanza. Per questi motivi, sono necessari nuovi efficaci farmaci antivirali. La proteina accessoria UL44 della DNA polimerasi di CMV, svolge un ruolo essenziale nella replicazione virale, conferendo processività alla subunità catalitica UL54 ancorando il complesso oloenzimatico al DNA. Il legame di UL44 al dsDNA avviene in assenza di ATP e dei clamp loaders, e dipende dalla omodimerizzazione di UL44. Il nostro gruppo di ricerca, infatti ha recentemente dimostrato che la proteina può dimerizzare in cellule e che mutazioni puntiformi in grado di inficiare tale dimerizzazione prevengono il legame con il DNA ed aboliscono la replicazione del DNA virale oriLyt-dipendente in saggi di transcomplementazione transiente. Perciò, la distruzione dell’omodimerizzazione UL44 rappresenta un potenziale ed allettante target per lo sviluppo di nuovi antivirali. Partendo da queste osservazioni ed usando la struttura cristallografica degli omodimeri UL44 che è stata recentemente pubblicata, il nostro gruppo di ricerca ha eseguito un virtual screening con il software Glide in combinazione con una libreria di 1.3 x 10^6 piccole molecole (SMs) per identificare SMs che potenzialmente potessero interferire con l’omodimerizzazione di UL44. Dopo tre rounds di screening (HTVS: high-throughput virtual screening, SP: standard precision, XP: extra precision), seguiti da un’analisi delle proprietà chimiche dei composti, sono state selezione 18 SM per ulteriori analisi. I composti selezionati sono stati acquistati presso un fornitore commerciale, per essere testati in diversi saggi per valutare le loro abilità di inibire l’omodimerizzazione di UL44 in vitro, sia la replicazione virale. Con questo scopo, abbiamo utilizzato due metodi in vitro per monitorare l’effetto dei nostri candidati sulla dimerizzazione di UL44, quali GST-pulldown assay e Thermal Shift Assay (TSA). Inoltre per studiare l’inibizione sulla replicazione virale sono stati eseguiti saggi di Plaque Reduction Assay (PRA) e Fluorescence Reduction Assay (FRA). Inizialmente abbiamo confermato che il GST-pulldown assay fosse idoneo per studiare la dimerizzazione di UL44 e la sua perturbazione causata dalle SMs. Pertanto abbiamo eseguito un primo screening per saggiare l’effetto delle 18 SMs sulla dimerizzazione di UL44, ed abbiamo identificato 3 molecole che inibivano la dimerizzazione in modo riproducibile. Incoraggiati da questi risultati, abbiamo selezionato queste SMs per valutare una possibile relazione dose-risposta tra l’inibizione della dimerizzazione e la concentrazione dei composti. Sfortunatamente, l’analisi dei dati hanno rivelato alta variabilità, e perdita di correlazione tra l’inibizione e la concentrazione delle SMs utilizzate nei saggi. In parallelo, abbiamo eseguito PRAs per validare l’effetto delle SMs precedentemente selezionate, ma queste si sono presentati incapaci di inibire la replicazione virale in modo consistente. Successivamente abbiamo ottenuto due virus CMV ricombinanti (TB4-IE2-EYFP and TB4-UL83-EYFP) da Michael Winkler (Leibniz-Institut für Primatenforschung Goettingen, Germany) per studiare l’effetto delle nostre molecole sulla replicazione di CMV mediante FRAs. Pertanto, dopo uno screening delle 18 SMs, 4 di queste sono state identificate come possibili inibitori della replicazione virale e sono state selezionate per essere ulteriormente studiate. Abbiamo valutato la loro dose effettiva 50% (ED50) e la loro concentrazione citotossica 50% (CC50) e gli effetti relativi all’espressione genica. Solo due SMs in modo riproducibile inibivano l’espressione dei geni Early e Late. Poi abbiamo valutato un saggio in vitro alternativo e tra le varie possibilità, abbiamo scelto il TSA che è un saggio in grado di informare se una SM induce la distruzione delle interfacce di un oligomero costitutivo. In un primo momento abbiamo confermato che il saggio permettesse la discriminazione tra le forme monomeriche e dimeriche di UL44, suggerendo il suo potenziale per lo screening delle nostre SMs. Come risultato di questo screening, una molecola ha rivelato possibile inibizione della dimerizzazione.