Agrobacterium-mediated transformation of Jatropha curcas to overexpress a gene involved in the triglyceride biosynthetic pathway

Le conseguenze negative derivate dall’uso dei combustibili fossili e la preoccupazione sulla durata delle riserve petrolifere hanno stimolato la ricerca di fonti di energia rinnovabili. Un biocarburante, per essere considerato una valida alternativa, deve essere poco inquinante, economicamente competitivo e deve poter essere prodotto in grandi quantità senza intaccare le risorse alimentari. Il biodiesel è uno dei biocarburanti più utilizzati al mondo e l’olio da cui deriva è costituito di trigliceridi (TAG), ovvero molecole di glicerolo esterificate con tre acidi grassi. La trans- esterificazione con metanolo di questi trigliceridi produce metil esteri di acidi grassi, che costituiscono il biodiesel vero e proprio, e glicerolo. La crescente domanda di specie in grado di produrre semi oleaginosi (come Brassica napus, Glycine max e Helianthus annuus) sta causando la riduzione delle aree agricole destinate alla coltivazione di colture edibili, causando l’aumento dei prezzi degli alimenti. L’obiettivo del progetto, in collaborazione con Geneticlab S.r.l., è l’ottenimento di protocolli in grado di indurre la produzione di biomassa e l’accumulo di lipidi in colture cellulari derivate da espianti di Jatropha curcas. Questa specie si adatta facilmente a climi semi aridi, è in grado di crescere su suoli poveri e marginali, è molto utile per combattere l’erosione e accumula molti trigliceridi nei semi. J. curcas è monoica, con fiori maschili e femminili sulla stessa infiorescenza; è una pianta originaria del Mexico o comunque del Centro America. Questa specie viene coltivata nelle zone tropicali e sub-tropicali e nei climi temperati caratterizzati da un’estate calda e l’assenza di una stagione secca. L’approccio sperimentale ha seguito due diverse direzioni: a) la messa a punto di protocolli in grado di stimolare la proliferazione cellulare a partire da diversi tipi di espianto; b) la ricerca di protocolli veloci e ripetibili utili alla propagazione della specie. La proliferazione cellulare è stata ottenuta, sia su mezzo solido che liquido con diverse concentrazioni di sali e di fitoregolatori. Le colture cellulari in sospensione sono state caratterizzate dimostrando che la biomassa ottenuta può aumentare fino a più di 7 volte, rispetto all’inoculo iniziale, in 3 settimane . La propagazione per talea è stata eseguita a partire da esemplari di diversa età e origine e la parte legnosa della pianta si è dimostrata essere la più efficiente nella radicazione. L’organogenesi da callo e la rigenerazione dell’intero individuo sono state ottenute in vitro; le piante così rigenerate riescono ad acclimatarsi all’ambiente naturale. La trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens è stata programmata per sovraesprimere un enzima coinvolto nella via biosintetica dei trigliceridi. Questa strategia potrebbe permettere l’ottenimento di colture cellulari in grado di accumulare trigliceridi in grandi quantità. Il gene codificante la diacilglicerolo aciltransferasi (DGAT) di A. thaliana è stato clonato nel vettore pG0029 sotto il controllo del promotore costitutivo 35S e, in particolare, sono stati preparati tre diversi vettori plasmidici: nel plasmide pG29Y è inserita la sequenza codificante per la proteina fluorescente YFP; nel plasmide pG29HD quella codificante per l’enzima DGAT e nel plasmide pG29HDY quella codificante per il prodotto di fusione DGAT::YFP. Colture cellulari trasformate con i plasmidi pG29Y e pG29HDY hanno permesso di osservare un segnale di fluorescenza con una diversa localizzazione sub-cellulare per i due costrutti; è infatti noto da dati presenti in letteratura che l’enzima DGAT svolge la sua funzione nella membrana del reticolo endoplasmatico. È stato inoltre ottimizzato un saggio utile alla quantificazione dei trigliceridi intracellulari che ha permesso di valutare l’accumulo di TAG nei semi e nelle colture cellulari di J. curcas. Questo saggio verrà eseguito sulle colture cellulari e sui diversi tessuti delle piante trasformati. Alcuni dei risultati ottenuti durante i 3 anni di questo progetto sono stati applicati con buoni risultati dalla ditta Geneticlab S.r.l., permettendo il trasferimento di tecnologia dalla scala di laboratorio a quella industriale.