HSP70/HSF1 axis has a role in the pathogenesis of Chronic Lymphocytic Leukemia and is a druggable target

La Leucemia Linfatica Cronica (LLC) è una malattia neoplastica, caratterizzata dall'accumulo di linfociti B clonali proliferanti e resistenti alla morte cellulare programmata. Questa leucemia è una malattia eterogenea: alcuni pazienti possono essere asintomatici, mentre altri sperimentano un decorso più aggressivo. Di conseguenza, nuove informazioni biologiche e citogenetiche sono necessarie per prevedere la prognosi del paziente e per curare la malattia attraverso la ricerca di nuove molecole coinvolte nella sua patogenesi. In precedenza, il nostro laboratorio aveva eseguito un'analisi di RPPA (Reverse Phase Protein Array) allo scopo di identificare nuove proteine coinvolte nella resistenza all'apoptosi e nella sopravvivenza delle cellule di LLC. Grazie a questo studio, abbiamo verificato che la Heat Shock Protein di 70kDa (HSP70) era significativamente sovraespressa nelle cellule di LLC rispetto ai controlli sani. HSP70 è uno chaperone molecolare indotto in risposta a numerosi insulti fisiologici e ambientali, che consente alle cellule di sopravvivere in condizioni altrimenti letali. Il principale responsabile della trascrizione di HSP70 è Heat Shock Factor 1 (HSF1), il quale, in risposta allo stress, è in grado di legarsi al DNA ed attivare la trascrizione dei geni dell’heat shock. Durante questo progetto triennale di dottorato, ci siamo focalizzati sulla caratterizzazione di HSP70 e del suo principale regolatore, HSF1, nella LLC. Abbiamo dimostrato che HSP70 e HSF1 sono sovraespresse (138 pazienti LLC, 1,24 ± 0,85 vs 32 controlli sani, 0,77 ± 0,57; p <0,01; 85 pazienti LLC 0,81 ± 0,77 vs 19 controlli sani, 0,30 ± 0,36; p <0,01, rispettivamente) e correlate a prognosi sfavorevole nella LLC. Abbiamo inoltre osservato che queste due proteine sono localizzate in modo anomalo nel nucleo delle cellule leucemiche. Nei pazienti che rispondevano a regimi terapeutici in vivo, abbiamo evidenziato una diminuzione dei livelli proteici di HSP70 e HSF1 e una correlazione positiva tra gli stessi (p <0,05; r = 0,94). Per comprendere meglio il ruolo di HSP70 e HSF1 nella LLC, le abbiamo inibite in vitro utilizzando molecole specifiche (VER-155008, KRIBB11, zafirlukast, fisetina), che si sono rivelate in grado di indurre apoptosi nelle cellule leucemiche da pazienti con LLC (vitalità a 24 ore: solo cellule LLC 63 ± 14%, vs cellule LLC + fisetina 15μM 35 ± 19%, p <0,0001). Inoltre, abbiamo dimostrato che la fisetina era in grado di oltrepassare la protezione fornita dal microambiente quando le cellule B neoplastiche erano poste in co-coltura con MSC e fisetina 15μM (senza MSC: 30 ± 17%, 25 ± 19%, 26 ± 15%; con MSC: 32 ± 14%, 35 ± 23%, 33 ± 22% a 24, 48, 72 ore). HSF1 non è regolato soltanto dalle sue interazioni con chaperoni molecolari, ma anche da un fine equilibrio tra fosforilazioni attivatorie e inibitorie. Poiché la maggior parte delle molecole che fosforilano HSF1 appartiene a due vie di segnalazione di RAS (PI3K/AKT/mTOR e RAF/MEK/ERK), sfruttando la nostra precedente analisi RPPA, abbiamo correlato HSP70 a diverse proteine appartenenti a questi pathway. Abbiamo diviso i nostri pazienti sulla base dei livelli di HSP70 in due gruppi: HSP70high e HSP70low, dimostrando che le proteine dei pathway di RAS sono regolate in modo diverso nei due gruppi. Per HSP70high abbiamo sviluppato un modello basato su elevati livelli di AKT-Ser473, che ha la capacità di inibire GSK3a/b che, a sua volta, non è più in grado di inibire HSF1. I pazienti HSP70low, invece, presentano elevati livelli di MEK1/2-Ser217/221 e ERK-Thr202/Tyr204, che regolano negativamente HSF1. Di conseguenza, l'attivazione del pathway PI3K/AKT/mTOR porta ad un'espressione più elevata di HSP70, mentre l'attivazione del pathway RAF/MEK/ERK determina una down-regolazione di HSP70. Abbiamo convalidato il nostro modello per la regolazione aberrante dell'asse HSP70/HSF1 nella LLC inibendo alcune molecole dei pathway di RAS. A questo scopo, abbiamo usato il resveratrolo, un polifenolo naturale in grado di inibire AKT ed attivare ERK. Dopo 24 ore di trattamento con resveratrolo alla dose di 40μM, abbiamo osservato una riduzione della vitalità cellulare (61 ± 18% delle cellule non trattate contro 54 ± 20% di quelle trattate; p <0,01) ed una ridotta espressione proteica di HSF1 e HSP70 (da 1,15 ± 0,69 a 0,50 ± 0,64 e da 1,13 ± 0,69 a 0,54 ± 0,35, rispettivamente, p <0,01). In conclusione, la sovraespressione di HSP70 e HSF1 e la loro correlazione con la resistenza alla terapia nella LLC, insieme alla capacità della fisetina di indurre apoptosi nelle cellule B leucemiche bypassando gli stimoli pro-sopravvivenza del microambiente tumorale, rappresentano un punto di partenza per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. Inoltre, lo studio degli effetti del resveratrolo sulle cellule B leucemiche fornisce nuove informazioni sul cross-talk tra l'asse HSP70/HSF1 e la via del segnale di RAS nella LLC.