Non Canonical structures within MYC and BCL2 oncogenes: novel targets for gene expression modulation.

Oggigiorno una delle “piaghe” che affligge maggiormente la popolazione mondiale è il cancro. Il trattamento di queste forme neoplastiche sfrutta agenti chemioterapici e radioterapici, caratterizzati da numerose limitazioni legate ai notevoli effetti collaterali, alla tossicità e alla selezione di fenotipi resistenti a tali terapie. Ciò ha portato allo sviluppo delle targeted therapy, che sfruttano entità chimiche (small molecules, anticorpi monoclonali, miRNA, siRNA ecc.) selettive per un bersaglio molecolare caratteristico del fenotipo tumorale. Nonostante più mirati anche questi approcci presentano degli effetti collaterali Pertanto la modulazione dell’espressione genica che sfrutta la capacità degli acidi nucleici di assumere differenti conformazioni, definite non canoniche, ha destato sempre più interesse. Tra le possibili strutture non canoniche di notevole interesse sono le conformazioni tetraelicoidali note come G-quadruplex (G4) e i-Motif (iM). La struttura G4 è propria di sequenze di DNA e RNA contenenti un’elevata abbondanza di guanine consecutive che, mediante legami a idrogeno di tipo Hoogstein, generano delle strutture planari chiamate tetradi. Dall’’impilamento di due o più tetradi si genera la struttura a tetraelica. Poiché il DNA è una doppia elica, il filamento complementare a queste regioni G ricche presenta un’elevata abbondanza di citosine. Anche questi domini in particolari condizioni ambientali, possono generare una conformazione tetraelicoidale, nota come i-Motif. A differenza del G4, il building block dell’intera struttura è un dimero di citosine stabilizzato dalla presenza di tre legami a idrogeno. In vivo l’esistenza di queste conformazioni, genera una sorta d’ingombro sterico a livello del DNA e ciò presuppone un effetto d’inibizione/attivazione del processo di elongazione del telomero o del processo trascrizionale. Sotto la supervisione del Dott. Laurence J. Hurley, è stata implementata la caratterizzazione strutturale della stringa di citosine contenute nel promotore del gene MYC. In seguito un selezionato ligando è stato testato con l’idea di poter modulare il processo di folding/unfolding alla base dell’attivazione trascrizionale. Infine, l’effetto mediato da questo composto sul processo apoptotico è stato preso in considerazione lavorando su una selezionata linea cellulare. Di notevole interesse sono le regioni GC-ricche contenute nella porzione non tradotta del trascritto primario (mRNA). Sulla base di ciò, in questo progetto, sono state prese in considerazioni, le stringhe di guanina e citosina contenute nella regione del 5’-UTR, sia a livello del DNA sia del RNA, del gene BCL2. Inizialmente è stato condotto uno studio di caratterizzazione sulle sequenze minimali dBcl2_G, dBcl2_C e rBcl2_G. In seguito è stato preso in considerazione l’effetto della presenza di nucleotidi adiacenti sul processo di folding verso il G-quadruplex (dBcl2_G + 3WC, rBcl2_G + 3WC e rBcl2_48). I dati ottenuti dimostrano che le sequenze dBcl2_G e rBcl2_G sono in grado di assumere molteplici conformazioni G4. La presenza di nucleotidi addizionali modula la loro capacità di assumere queste conformazioni. In particolare, la presenza di tre appaiamenti WC impedisce parzialmente la formazione del G4 sia nel DNA, che nel RNA mentre, l’aggiunta di un maggior numero di basi (rBcl2_48) sposta l’equilibrio conformazionale verso una conformazione in forte competizione con il G4. Per la sequenza ricca di citosine, l’equilibrio conformazionale è stato valutato sia in ambiente blandamente acido, che in un ambiente che mima la condizione fisiologica. Infine, poiché negli ultimi anni è stata dimostrata la capacità di alcuni ligandi sintetici/naturali, di spostare gli equilibri conformazionali del DNA, dalla classica forma a doppio filamento, verso queste conformazioni tetraelicoidali, una selezionata libreria di composti è stata, scrinata allo scopo di individuare un ligando in grado di riconoscere e stabilizzare selettivamente una conformazione al pari di un'altra.