IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF A NOVEL NFIX PHOSPHORYLATION IN SKELETAL MUSCLE

Nfix is a transcription factor involved in several biological processes spanning from the development of different tissues (brain, muscle, immune system) to cancer. Mutations in the Nfix gene are also at the basis of rare genetic disorders: the Malan syndrome and the Marshall-Smith syndrome. In skeletal muscle, Nfix drives the transition from embryonic to fetal myogenesis in developmental myoblasts and the skewing from M1 to M2 macrophages. In the adult, Nfix plays a role in the maintenance of the correct timing of skeletal muscle regeneration upon injury regulating the expression of key genes in muscle stem cells. Silencing Nfix in dystrophic mice leads to a morphological and functional amelioration of the dystrophic phenotype by slowing down the degeneration-regeneration cycles, switching muscle fibers towards a slow-twitching phenotype, and by limiting the deposition of fibrotic tissue. Despite the key roles of this transcription factor, a thorough understanding of its regulatory mechanisms in skeletal muscle and pathological conditions is lacking. Studies focusing on Nfix post-translational modifications (PTMs) are highly underrepresented in the literature. This works aims to fill this knowledge gap, through the characterization of the post-translational modifications of this protein and their biological role. With this work, we demonstrate that Nfix is phosphorylated in skeletal myoblasts, both in fetal myoblasts during development and in adult muscle cells, in vitro and in vivo. The presence of at least one phosphorylation site in the C-terminal, transcriptionally active domain of Nfix, phospho-serine 301 (pS301), was confirmed both in vitro and in vivo in skeletal muscle cells and tissue. Our data are backed by several other high-throughput proteomics data, including data from human muscle biopsies. Furthermore, a search for cancer-relevant variants of S301 on cBioPortal Cancer Genomics database revealed a melanoma patient with a phosphorylation-disruptive serine-to-phenylalanine (S301F) mutation, suggesting a possible role of Nfix phosphorylation in cancer mechanisms. Serine 301 is very well-conserved among Nfix vertebrate orthologs, suggesting a functional relevance. This phosphorylation can be recognized as a slower migrating Nfix species in western blot experiments of cultured myoblasts. The phosphorylation-mediated mobility shift is dependent on the phosphate negative charge, as demonstrated by the S301D (serine-to-aspartate substitution) phosphomimetic Nfix variant. Ser 301 phosphorylation is detected already during fetal myogenesis and its levels remain constant during differentiation of postnatal myoblasts in culture. Data from cell lines obtained from murine Nfix-null myoblasts expressing phospho-deficient (S301A) and phospho-mimetic (S301D) Nfix mutants reveal no evident phenotypical abnormalities, both in proliferation and differentiation. Strikingly, we found that this phosphorylation is induced upon late activation of muscle stem cells (MuSCs), as it is absent in freshly isolated MuSCs but present in cultured ones. RNA-seq experiments performed on S301A-, S301D-, and Nfix2_WT-expressing myoblasts revealed a common role for Nfix in regulating cell cycle, differentiation, cell metabolism, and cell adhesion processes, all pathways differentially regulated between quiescent and activated MuSCs. We have also shown that this phosphorylation is sensitive to oxidative stress and proteasome inhibition, as it significantly decreases upon hydrogen peroxide (H2O2) and proteasome inhibitors treatment in myoblasts. Intriguingly, the regulation of Nfix phosphorylation by oxidative stress could have interesting impacts in a dystrophic context, where reactive oxygen species such as H2O2 are abundant and dysregulated. However, pS301-Nfix levels are unchanged among wild-type and dystrophic sgca-null muscles, when detected via western blot. To conclude, we highlight a possible role for pS301-Nfix in the regulation of MuSCs activation, cell cycle progression, and cell adhesion. Furthermore, Nfix phosphorylation levels could be tuned by the cells' metabolic state via reactive oxygen species. The importance of this study relies on the clarification of Nfix regulatory mechanisms, a knowledge that could be employed in a dystrophic context to manipulate Nfix transcriptional activity and modulate MuSCs biology. Furthermore, the dysregulation of Nfix phosphorylation could have a role in Marshall-Smith syndrome pathogenesis. Indeed, the Nfix residues interested by phosphorylation are coded by exons 5 to 8, which are the most affected by mutations in Marshall-Smith patients, that are characterized by de novo heterozygous mutations in the Nfix C-terminal domain, generating mutant proteins that seem to acquire dominant-negative/gain-of-function properties. An impaired interpretation of signaling pathways downstream of Nfix phosphorylation could be a relevant pathogenic mechanism of Marshall-Smith syndrome.

Nfix è un fattore di trascrizione coinvolto in diversi processi biologici che vanno dallo sviluppo di diversi tessuti (cervello, muscoli, sistema immunitario) ai tumori. Mutazioni del gene Nfix sono anche alla base di due malattie genetiche rare: la sindrome di Malan e la sindrome di Marshall-Smith. Nel muscolo scheletrico, Nfix guida la transizione dalla miogenesi embrionale a quella fetale durante lo sviluppo. Nell'adulto, Nfix regola la corretta tempistica di rigenerazione del muscolo scheletrico in seguito a una lesione, regolando l'espressione dei geni chiave nelle cellule staminali muscolari e la conversione dei macrofagi da fenotipo M1 a M2. Il silenziamento di Nfix nei topi distrofici porta a un miglioramento morfologico e funzionale del fenotipo distrofico rallentando i cicli di degenerazione-rigenerazione, indirizzando le fibre muscolari verso un fenotipo a contrazione lenta, e limitando la deposizione di tessuto fibrotico. Nonostante il ruolo chiave di questo fattore di trascrizione, ad oggi manca una comprensione approfondita dei suoi meccanismi regolatori nel muscolo scheletrico e in condizioni patologiche. Studi incentrati sulle modifiche post-traduzionali di Nfix sono fortemente sottorappresentati in letteratura. Questo lavoro mira a colmare questa lacuna conoscitiva, attraverso la caratterizzazione delle modificazioni post-traduzionali di questa proteina e il loro ruolo biologico. Con questo lavoro, dimostriamo che Nfix è fosforilato nei mioblasti del muscolo scheletrico, sia nei mioblasti fetali durante lo sviluppo che nelle cellule muscolari adulte, in vitro e in vivo. La presenza di almeno un sito di fosforilazione nel dominio C-terminale, trascrizionalmente attivo di Nfix, fosfo-serina 301 (pS301), è stata confermata sia in vitro che in vivo nelle cellule e nei tessuti muscolari scheletrici. I nostri dati sono supportati da numerosi dati di proteomica, inclusi dati provenienti da biopsie muscolari umane. La serina 301 di Nfix è molto ben conservata in diverse specie di vertebrati, suggerendo una importanza funzionale. La carica negativa portata dal gruppo fosfato sulla serina 301 causa una alterata corsa elettroforetica di Nfix e può pertanto essere riconosciuto tramite esperimenti di western blot. La fosforilazione della Ser 301 viene rilevata già durante la miogenesi fetale e i suoi livelli rimangono costanti durante il differenziamento dei mioblasti postnatali in coltura. Dati provenienti da linee cellulari ottenute da mioblasti murini Nfix-null trasdotti con mutanti fosfo-deficienti (S301A) e fosfo-mimetici (S301D) di Nfix non rivelano anomalie fenotipiche evidenti, sia in proliferazione che in differenziamento. Questa fosforilazione è invece indotta con l’attivazione delle cellule staminali muscolari (MuSC), poiché è assente nelle MuSC appena isolate dal tessuto (quiescenti) ma presente in quelle messe in coltura (attivate). Esperimenti di RNA-seq eseguiti su mioblasti che esprimono S301A-, S301D- ed Nfix2_WT hanno rivelato un ruolo di Nfix nella regolazione del ciclo cellulare, differenziamento, metabolismo cellulare e nei processi di adesione cellulare, tutti processi differenzialmente regolati tra MuSC quiescenti e attivate. Abbiamo inoltre dimostrato che questa fosforilazione è sensibile allo stress ossidativo e all'inibizione del proteasoma, poiché diminuisce significativamente in mioblasti trattati con perossido di idrogeno (H2O2) e inibitori del proteasoma. Per concludere, evidenziamo un possibile ruolo per pS301-Nfix nella regolazione dell'attivazione delle cellule staminali del muscolo e nella progressione del ciclo cellulare. La scoperta di questi nuovi meccanismi regolatori di Nfix potrebbe essere impiegata in un contesto distrofico per manipolare l'attività trascrizionale di Nfix e modulare la biologia delle ceullule staminali del muscolo. Inoltre, la disregolazione della fosforilazione di Nfix potrebbe avere un ruolo nella patogenesi della sindrome di Marshall-Smith. Infatti, i residui Nfix interessati dalla fosforilazione sono codificati dagli esoni da 5 a 8, che sono i più colpiti dalle mutazioni nei pazienti affetti da sindrome di Marshall-Smith, i quali sono caratterizzati da mutazioni eterozigoti nel dominio C-terminale di Nfix, generando proteine mutanti che sembrano acquisire proprietà di dominanti negativi. Un'interpretazione alterata delle vie di segnalazione a valle della fosforilazione di Nfix potrebbe essere un meccanismo rilevante della sindrome di Marshall-Smith.