Molecular Characterization of VHL Family Proteins: when Similarities make the Difference

Le mutazioni che colpiscono i cosiddetti “geni di suscettibilità al cancro” alterano la funzione biologica di alcune proteine chiave, come nel caso del gene oncosoppressore von Hippel-Lindau (VHL). Individui portatori di mutazioni loss-of-function sul gene VHL sviluppano una predisposizione famigliare autosomica dominante al cancro, chiamata sindrome di von Hippel-Lindau (VHL, OMIM 193300). La patologia è caratterizzata dalla diffusione di tumori o cisti, benigni o maligni, in differenti organi2. Nelle cellule sane, la funzione maggiormente nota di pVHL30 riguarda la regolazione del fattore di trascrizione HIF-1α, il quale a sua volta media e regola la risposta adattiva all’ipossia. Se alterato, questo meccanismo di regolazione può sostenere lo sviluppo tumorale. Nonostante la sindrome VHL sia classificata come famigliare predisposizione al cancro, la correlazione tra genotipo e fenotipo non risulta univoca nei pazienti. Ciò potrebbe trovare spiegazione nelle caratteristiche intrinseche della proteina in questione. pVHL30 viene infatti classificata come hub multifunzionale capace di interagire con più di 500 diversi interattori3, partecipando così a differenti funzioni cellulari. La fitta rete di interazioni proteiche attorno a pVHL30 è stata ampiamente studiata negli anni, con lo scopo di chiarirne le implicazioni funzionali. Per questo, durante il mio percorso di dottorato, ho cercato di caratterizzare nuovi interattori di pVHL30 combinando approcci computazionali e sperimentali. Dagli esperimenti, è emersa una nuova associazione tra pVHL30 e la famiglia degli inibitori delle chinasi ciclina-dipendenti 1 (CDKN1), strutturalmente simile al legame tra pVHL30 ed HIF-1α. L’interazione infatti coinvolge sia il dominio β di pVHL30 sia la regione N-terminale delle proteine CDKN1, nella quale è contenuto il dominio CDI caratterizzato da un motivo CODD-like. Inoltre, la plasticità di pVHL30 è stata studiata sfruttando sia pVHL172, isoforma alternativa del gene VHL, sia la proteina paralogo VLP. In particolare, sono state valutate le interazione con HIF-1α, CDKN1 e MDM2, quest’ultima identificata come nuovo interattore di pVHL30 in un lavoro parallelo non ancora pubblicato. Le diverse interazioni hanno evidenziato una tendenza isoforma-specifica, suggerendo per la porzione N-terminale un ruolo di regione discriminante nella scelta degli interattori. Esperimenti di microscopia confocale in cellule di mammifero mostrano inoltre una distribuzione diffusa di entrambe le isoforme, pVHL30 e pVHL172. Diversamente l’isoforma pVHL19 e il paralogo VLP, che mancano interamente (o parzialmente) della regione N-terminale, sono localizzate nel citosol in strutture definite punctate. Lo stesso viene osservato con il mutante tronco dell’isoforma VHL172 (pVHL172-ΔNT), evidenziando indirettamente che la localizzazione delle strutture VHL è regolata dalla regione N-terminale. Mediante frazionamento biochimico, è stato osservato che le isoforme caratterizzate dalla coda N-terminale completa, sono maggiormente presenti della frazione cellulare solubile. Al contrario, l’assenza della regione N-terminale aumenta marcatamente la presenza delle proteine nella frazione insolubile. Complessivamente, queste evidenze isoforma-specifiche suggeriscono un possibile ruolo funzionale distinto per ciascun membro della famiglia delle proteine VHL. In altre parole, queste strutture alternative di pVHL30 potrebbero essere frutto dell’evoluzione per sostenere funzioni tessuto-specifiche o competere per il legame con specifici partners. Entrambe le situazioni evidenziano ruoli biologici diversi al fine di regolare multiple o alternative vie di funzione nella cellula4. Alla luce di questi risultati significativi, è stato eseguito uno screening di libreria di cDNA tessuto-specifico in lievito per approfondire l’interattoma del paralogo VLP. Sono stati identificati e sequenziati 96 frammenti interagenti, ciascuno corrispondente ad una proteina diversa. Un’analisi computazionale preliminare ha rivelato che i partners di VLP sono principalmente localizzati nel nucleo e nel citosol, partecipando a tre principali funzioni cellulari (come regolazione dell'adesione extracellulare, rimodellamento del citoscheletro, nonché sopravvivenza e proliferazione cellulare). Inoltre, alcuni di questi interattori risultano caratterizzati da domini funzionali (come WD, LIM, ARM e zinc finger) comunemente presenti nelle proteine di scaffold, proponendo la possibile partecipazione di VLP in differenti complessi proteici. Più in generale, considerando la novità dei risultati ottenuti attraverso lo screening, la somiglianza strutturale con pVHL30 e l’espressione ubiquitaria di pVHL30, si può ipotizzare che queste nuove interazioni di VLP possano rappresentare un sottoinsieme di nuovi interattori di pVHL30. In altre parole, essi rappresentano un esempio di partner di pVHL30 tessuto-specifici. Sperimentalmente potrebbe essere possibile validare questa ipotesi eseguendo lo stesso screening utilizzando pVHL30 come esca (bait) del sistema doppio ibrido. D'altra parte, questo sottoinsieme di interattori specifici per VLP potrebbe essere frutto di un’evoluzione genica per rispondere alle esigenze specifiche del tessuto in questione. Se confermati, questi dati potrebbero aiutare a spiegare come l'alterazione funzionale della famiglia delle proteine VHL promuova l'insorgenza del cancro.