Forme congenite di malattia di von Willebrand senza mutazioni nel gene del fattore von Willebrand: alla ricerca di un nuovo gene e di nuovi meccanismi patogenetici

Il fattore von Willebrand (VWF) è una glicoproteina multimerica che svolge una funzione fondamentale nelle prime fasi dell’emostasi. Alterazioni quantitative o funzionali della molecola causano la malattia di von Willebrand (VWD), la più frequente malattia emorragica ereditaria. L’unico gene a tutt’oggi riconosciuto come responsabile della VWD è il gene del VWF. Tuttavia in una percentuale rilevante di casi di VWD (25-30%) non sono identificate mutazioni a carico del gene VWF. In questo lavoro di Dottorato è stata elaborata una flow-chart diagnostica per lo studio sistematico di famiglie con VWD che non presentano mutazioni nel gene VWF. Il punto focale della flow-chart è l’utilizzo dell’analisi di linkage con marcatori VNTR (variable number tandem repeat) interni al gene del VWF, per valutare il coinvolgimento del gene stesso: se aplotipo di VNTR e malattia co-segregano l’indagine del gene VWF deve essere approfondita con l’analisi del mRNA o con la Real-Time PCR, in caso contrario viene proposta un’indagine estesa a tutto il genoma per la ricerca di un nuovo gene causativo. Nella prima famiglia studiata (Famiglia A), i marker VNTR segregavano con la malattia e l’analisi del mRNA del VWF ha permesso di evidenziare uno splicing aberrante causato da una sostituzione sinonimo (c.7056C>T), già erroneamente classificata come polimorfismo. L’espressione in vitro del VWF mutato, condotta in linea cellulare BHK, ha permesso di dimostrare che la mutazione agisce con un tipico meccanismo di loss-of-function. L’analisi del mRNA si è rivelata utile anche per identificare la mutazione responsabile della VWD nella seconda famiglia (Famiglia B): una delezione genomica di 3411 paia di basi che coinvolge tre esoni del gene VWF (c.5456_5842del). In questo caso, l’espressione transiente in sistema cellulare HEK293T ha evidenziato un effetto dominante-negativo della mutazione nel rilascio del VWF. Lo studio funzionale è stato invece condotto attraverso l’espressione, in batteri E.coli, di frammenti ricombinanti di VWF mutato e normale (A2-B3). Questi frammenti sono stati sottoposti in vitro all’azione di ADAMTS13, una metalloproteasi che ha come unico substrato il VWF di cui regola la struttura multimerica. Questi esperimenti hanno dimostrato che la mutazione c.5456_5842del rende il VWF resistente all’azione proteolitica di ADAMTS13, offrendo così una spiegazione alla presenza di multimeri a peso molecolare abnormemente elevato in pazienti portatori di questa mutazione. Nella terza famiglia (Famiglia C) l’analisi di linkage ha escluso il coinvolgimento del gene VWF nell’insorgenza della VWD. Successivamente mediante sequenziamento diretto, è stato escluso anche un possibile ruolo per il gene del FVIII ed è stata quindi effettuata la ricerca di un nuovo gene causativo di VWD, utilizzando simultaneamente due diversi approcci: il sequenziamento dell’intero genoma e l’analisi di linkage familiare genome-wide. I dati derivati dalle due strategie sono stati integrati e il risultato ci ha permesso di identificare ~900 variazioni a carico di 396 geni distribuiti su 4 diverse regioni di linkage (cromosoma 5, 7, 15, X). Il contributo dei geni “candidati” presenti nelle regioni di linkage è stato valutato in maniera approfondita ma fino a questo momento non è stato possibile identificare quello responsabile della patologia emorragica. Il completamento dell’analisi di questa famiglia richiede una nuova fase di sequenziamento. La quarta e ultima famiglia (Famiglia D), le cui ridotte dimensioni non hanno consentito di eseguire l’analisi di linkage, è caratterizzata da una riduzione della sopravvivenza del VWF circolante. L’evidenza che anche il VWF esogeno (da emoderivato) presentava una ridotta sopravvivenza, ha escluso il coinvolgimento del gene VWF. Il sequenziamento genico ha permesso anche di escludere il coinvolgimento dell’ADAMTS13, così come la ricerca di anticorpi anti-VWF, in un quadro di malattia autoimmune, ha dato esito negativo. In conclusione, l’utilizzo della flow-chart proposta ha permesso di caratterizzare due nuove mutazioni sul gene VWF, responsabili per le forme di VWD delle Famiglie A e B. È opportuno sottolineare che entrambe le mutazioni descritte non potevano essere rilevate con il sequenziamento standard per limiti intrinseci della tecnica, mentre il sequenziamento del mRNA suggerito dalla flow-chart ha permesso la caratterizzazione di due casi irrisolti di VWD. Nelle famiglie C e D lo studio effettuato ha invece escluso definitivamente il coinvolgimento del gene VWF, confermando l’esistenza di altri fattori/geni responsabili di VWD.