LEPTIN SIGNALING IN AN ANIMAL MODEL OF ANOREXIA NERVOSA: EVIDENCE FOR (MAL)ADAPTIVE PLASTICITY IN REWARD- AND COGNITIVE-RELATED BRAIN AREAS

Anorexia Nervosa (AN) is a devastating psychiatric disorder characterized by self-imposed food restriction and constant fear of gaining weight that, combined with intense physical activity, leads to massive body weight loss. AN affects almost 1% of women worldwide, with an incidence rate among young females nine times more than males. The onset of this disease usually occurs during adolescence, a highly vulnerable period of life. AN is also characterized by a high comorbidity rate and the highest mortality rate among all mental disorders, 12-fold higher than the expected rate between 15- to 24-year-old females. When self-starvation begins, individuals experience positive and rewarding feelings over food control and physical activity, which can become compulsive, resulting in an out-of-control spiral that can ultimately drive anorexic patients to death. Indeed, all the pharmacological treatments that are typically symptomatic result in being ineffective. At neurobiological level, one of the mainly accredited hypotheses suggests that the abnormal behavior underlying this pathology is due to an altered balance between reward and inhibition mechanisms. Such dysfunctional mechanisms in the brain, combined with emotional dysregulation, could contribute to the distorted response to salient stimuli, i.e., food, corroborating the maintenance of the anorexic phenotype. In addition, malnutrition can cause dysfunctions in numerous neuropeptides, such as leptin, an appetite-regulating adipokine produced by the adipose tissue. These dysfunctions can occur in both the central nervous system as well as in the periphery, driving adaptive changes in energy storage status and maladaptive behaviors typical of AN patients. Studies in adolescent females with AN have shown a reduction of serum leptin levels compared to healthy adolescents and, further, hypoleptinaemia has been linked to elevated levels of physical exercise. Despite this evidence, how the action of leptin in extra-hypothalamic brain areas might contribute to sustain AN aberrant behavior still needs to be explored. To mimic AN in rodents, the activity-based anorexia (ABA) rat model has been developed. Although this model is not helpful for evaluating the psychological implications that lead to the onset of AN, the ABA model is still the gold standard for investigating the neurobiological changes implicated in this disease since it exhibits the two hallmarks of AN (self-induced pathological body weight loss and voluntary excessive exercising). In brief, adolescent female rats are exposed to a feeding schedule limited to two hours per day combined with free access to an activity wheel, thus leading to body weight loss and hyperactivity. Thus, the main aim of this project was to expand the understanding of the molecular basis of AN during a critical developmental period, i.e., adolescence, by unraveling the modulation of the leptin system in different brain areas and its contribution in inducing cognitive dysfunctions and compulsive behavior, typical of AN. In particular, we aimed to unravel the role of leptin as a molecular link between peripheral organs and the brain in the ABA rat model and to understand the contribution of leptin in AN-induced reward and cognitive impairments at the achievement of the anorexic phenotype (acute phase of the disease) and following a period of body weight recovery to identify molecular scars that may be left. As already demonstrated by our research group, adolescent female rats exposed to the ABA paradigm reduced body weight and concomitantly increased their running activity on the wheel, thus developing the anorexic phenotype. For instance, in line with the literature, ABA rats showed markedly reduced plasma leptin levels at the achievement of the anorexic phenotype, while leptin levels increased above the homeostatic levels after weight recovery, pointing to its dysregulation as a potential driver for neurobiological impairments and a risk factor for relapse. To explore the impact of the combination of food restriction and physical exercise on the leptin intracellular pathway, we performed molecular analysis on brain areas critically involved in reward-related features, such as the nucleus accumbens (NAc) and the prefrontal cortex (PFC), and learning and memory, such as the hippocampus (Hip). The LepR-JAK2-STAT3 pathway shows maladaptive long-term responses with a brain region-specific pattern; interestingly, a dysregulation in this pathway in extra-hypothalamic areas persists even after weight restoration, suggesting that leptin might be involved in maintaining maladaptive symptoms underlying AN-induced vulnerability. In particular, the combination of food restriction and hyperactivity is able to persistently downregulate the LepR system in the NAc, whereas in the PFC, the ABA-induced downregulation of the pathway in the acute phase was paralleled by a hyperactivation following body weight restoration. Furthermore, according to the evidence that leptin signaling in these brain areas regulates dopaminergic neurotransmission, we observed an impairment in dopaminergic determinants involved in regulating dopamine (DA) concentration depending on the brain region and the phase of the pathology analysed. At the achievement of the AN phenotype, in the NAc, the increased DA content and hyperdopaminergic state, previously observed in ABA rats, might be sustained by our molecular analysis that show increased tyrosine hydroxylase (TH) expression, reduced DA transporter (DAT) membrane localization and increased D2 receptor expression. On the contrary, despite increased DA content and reduced DAT levels in the PFC, TH, D1 and D2 levels were reduced, suggesting that the system could counteract the hyperdopaminergic tone. Body weight recovery was not able to restore these changes. Moreover, the persistent increase in D2 receptor levels in the NAc might contribute to the impaired ability of ABA rats to respond to salient stimuli, such as palatable food, in the CPP test. Thus, molecular and behavioral evidence that we collected suggests that ABA rats, probably via modulation of leptin-DA systems, couldn’t recognize positive stimuli or experience pleasure in consuming palatable food. Since it has been shown that LepR can regulate neuronal processes that underlie hippocampal-dependent memory formation, we evaluated the impact of the AN phenotype on the LepR-JAK2-STAT3 pathway, differentiating the two subregions of the Hip: the dorsal (dHip) and the ventral (vHip) part. In dHip, mainly involved in controlling cognitive functions, including memory, learning and spatial contextual detection, the combination of food restriction and intense physical exercise caused an overall reduction of the leptin intracellular pathway. This effect was paralleled by increased autophagic mechanisms in the acute phase and pro-apoptotic signaling following body weight recovery. These effects can influence and alter intracellular information processing, causing persistent impairment in cognitive functions, as observed in the spatial order object recognition test. In the vHip, a subregion primarily associated with moderating affective states, the anorexic phenotype induced a shift from a hypo- to over-activation in the leptin pathway when moving from the acute phase to weight recovery, thus resulting in differential modulation of STAT3-dependent gene expression involved in the structural organization of the excitatory synapse. In particular, ABA rats in the acute phase of the pathology showed reduced spine density and mushroom- shaped spines together with reduced PSD95 and Neuroligin-1 levels, strongly indicating a reorganization of the hippocampal synaptic structure. This structural dysregulation was paralleled by increased localization of NMDA and AMPA receptor subunits in the post- synaptic density and the extra-synaptic sites. The persistent structural and molecular reorganization of the excitatory synapse, potentially leading to enhanced glutamatergic transmission despite reduced spine density, may drive excitotoxicity, synaptic destabilization and, thus, maladaptive plasticity even after body weight recovery. In conclusion, the obtained results point toward the modulation of the leptin pathway as a critical factor underlying maladaptive behavior in AN, providing novel insights into the involvement of a periphery-to-brain crosstalk. In parallel to the involvement of the leptin pathway, the dysregulation of dopaminergic, autophagic, and glutamatergic mechanisms highlights the complex interplay between these systems, suggesting their contribution to the alteration of reward mechanisms related to feeding and hyperactivity, as well as to cognitive impairments, also observed in AN patients. Altogether, these dysfunctions enrolled first to adapt the individual to starvation switch toward persistent maladaptive alterations that might trigger, at least in part, the reiteration of aberrant behaviors typical of AN patients and the vulnerability to develop other psychiatric comorbid symptoms and to increase the risk of relapse.

L'Anoressia Nervosa (AN) è un disturbo psichiatrico caratterizzato da una volontaria restrizione alimentare e da una costante paura di ingrassare, le quali insieme ad un'intensa attività fisica, portano ad una rilevante perdita di peso corporeo. L'AN colpisce quasi l'1% della popolazione femminile in tutto il mondo, con un tasso di incidenza tra le giovani donne di nove volte superiore a quello dei maschi. Solitamente l'insorgenza di questa patologia avviene durante l'adolescenza, un periodo della vita altamente vulnerabile. L'AN è inoltre caratterizzata da un alto tasso di comorbilità e dal tasso di mortalità più elevato tra tutti i disturbi psichiatrici, in quanto questo risulta 12 volte superiore al tasso previsto tra le giovani donne tra i 15 e i 24 anni. Dal momento in cui iniziano ad auto-imporsi diete restrittive, gli individui provano sensazioni positive e gratificanti nel controllo del cibo e dell'attività fisica, che possono causare lo sviluppo di comportamenti compulsivi ed ossessivi, instaurando un circolo vizioso che può portare le pazienti anoressiche alla morte. In questo scenario, tutti i trattamenti farmacologici, che sono tipicamente sintomatici, risultano inefficaci. A livello neurobiologico, una delle ipotesi più accreditate riguardo l’insorgenza dell’AN suggerisce che il comportamento anomalo sia dovuto ad uno squilibrio tra i meccanismi cerebrali di ricompensa e di inibizione. Tali meccanismi disfunzionali nel cervello, in concomitanza con un alterato stato emotivo, potrebbero contribuire ad indurre un’alterata risposta a stimoli piacevoli, come il cibo, corroborando il mantenimento del fenotipo anoressico. In aggiunta a ciò, la malnutrizione altera la funzionalità di diversi neuropeptidi come la leptina, una adipochina prodotta e secreta dal tessuto adiposo. Queste disregolazioni, che possono avvenire sia a livello del sistema nervoso centrale che a livello periferico, inducono cambiamenti adattativi nei meccanismi che regolano lo stato energetico dell’organismo così come potrebbero essere alla base dei comportamenti maladattativi tipici delle pazienti affette da AN. Studi su ragazze adolescenti affette da AN hanno mostrato una riduzione dei livelli circolanti di leptina rispetto ad adolescenti sane. Inoltre, è stato dimostrato che l'ipoleptinemia potrebbe contribuire all'aumento dei livelli di esercizio fisico. Nonostante queste evidenze, il ruolo della leptina nella regolazione di aree cerebrali extra-ipotalamiche così come il suo contributo nel sostenere i comportamenti anomali nell’AN rimangono ancora inesplorati. Allo scopo di mimare le principali caratteristiche dell’AN nei roditori, è stato messo a punto un modello animale chiamato “activity-based anorexia” (ABA), che presenta le due principali caratteristiche dell’AN, ovvero la perdita di peso corporeo e l’eccessivo esercizio fisico volontario. Nonostante questo modello non sia utile per valutare le implicazioni psicologiche che portano all'insorgenza dell'AN, è il modello di riferimento per indagare le alterazioni neurobiologiche implicate in questa patologia. In particolare, ratte femmine adolescenti vengono sottoposte ad un paradigma di restrizione alimentare, in cui ricevono cibo per due ore al giorno, in concomitanza con la possibilità di avere libero accesso ad una ruota di attività: la combinazione di queste due condizioni causa la perdita di peso corporeo e iperattività. L'obiettivo principale di questo progetto di dottorato è stato quello di approfondire la comprensione delle basi molecolari dell'AN durante un periodo critico dello sviluppo, ovvero l'adolescenza, esaminando la modulazione del sistema della leptina in diverse aree cerebrali e il suo contributo nell'indurre disfunzioni cognitive e comportamenti compulsivi tipici delle pazienti affette da AN. In particolare, il nostro obiettivo è stato quello di verificare il ruolo della leptina come potenziale collegamento molecolare tra organi periferici e cervello nel modello ABA e di comprendere il contributo di questa adipochina nelle disfunzioni legate al circuito della ricompensa e all’ambito cognitivo. A questo scopo, abbiamo svolto le analisi molecolari sia al raggiungimento del fenotipo anoressico, per ottenere informazioni riguardo la fase acuta della malattia, sia a seguito di un periodo di recupero del peso corporeo, in modo tale da identificare eventuali "cicatrici molecolari" che potrebbero persistere nel tempo. Come già dimostrato dal nostro gruppo di ricerca, ratte femmine adolescenti esposte al paradigma ABA mostrano una graduale riduzione del peso corporeo ed un concomitante aumento dell’attività di corsa sulla ruota, sviluppando così il fenotipo anoressico. Inoltre, in linea con la letteratura scientifica, le ratte ABA hanno mostrato una riduzione dei livelli di leptina plasmatica al raggiungimento del fenotipo anoressico e un aumento dopo il recupero del peso corporeo, indicando alterazioni nei livelli di questo ormone come possibile fattore di rischio nell’insorgenza di disfunzioni neurobiologiche e nella comparsa di episodi di ricaduta. Per valutare l’impatto della combinazione fra restrizione alimentare e attività fisica sulla via di segnalazione intracellulare della leptina, abbiamo svolto le analisi molecolari in aree cerebrali strettamente coinvolte nella regolazione dei meccanismi di ricompensa, come il nucleus accumbens (NAc) e la corteccia prefrontale (PFC), e dei meccanismi di apprendimento e memoria, come l’ippocampo (Hip). Nelle ratte ABA, la via di segnalazione intracellulare LepR-JAK2-STAT3 ha mostrato alterazioni che persistono anche dopo il ripristino del peso corporeo in modo area- dipendente, suggerendo un coinvolgimento della leptina nel mantenimento dei sintomi maladattativi sottostanti la vulnerabilità indotta dall'AN. In particolare, la combinazione di restrizione alimentare e iperattività è in grado di ridurre in modo persistente il sistema della leptina nel NAc. Nella PFC, invece, la riduzione indotta dall’esposizione al modello ABA nella fase acuta è seguita da un'iperattivazione a seguito del recupero del peso corporeo. Inoltre, in accordo con evidenze che mostrano che la via di segnalazione della leptina è in grado di regolare la trasmissione dopaminergica, abbiamo osservato che i determinanti dopaminergici coinvolti nella regolazione della concentrazione di dopamina (DA) vengono alterati in modo differente a seconda della regione cerebrale e della fase della patologia analizzata. Al raggiungimento del fenotipo AN, nel NAc, l’aumentata concentrazione di DA e lo stato iperdopaminergico osservato in letteratura nelle ratte ABA potrebbero essere sostenuti dal punto di vista molecolare dall'aumento dell'espressione dell’enzima tirosina idrossilasi (TH), dalla ridotta localizzazione del trasportatore della DA (DAT) in membrana e dall'aumento dell'espressione del recettore D2 che abbiamo osservato nel nostro modello. Al contrario, nonostante l’aumentata concentrazione di DA e i ridotti livelli di DAT nella PFC dei ratti ABA, TH, D1 e D2 sono ridotti, suggerendo che il sistema è stato in grado di contrastare il tono iperdopaminergico presente nella PFC. Il recupero del peso corporeo non ripristina i cambiamenti osservati. Inoltre, l’aumento persistente dei livelli del recettore D2 nel NAc potrebbe contribuire alla compromessa capacità delle ratte ABA di rispondere a stimoli positivi, quali cibo palatabile, nel test della CPP. Pertanto, le evidenze molecolari e i dati comportamentali che abbiamo raccolto suggeriscono che le ratte ABA, probabilmente attraverso una disregolazione dei sistemi leptina-DA, non risultano in grado di discernere stimoli positivi o di provare piacere nel consumare cibo palatabile. Siccome è stato dimostrato che il LepR può regolare anche i processi neuronali che sottendono la formazione della memoria dipendente dall'ippocampo, abbiamo valutato l'impatto del fenotipo anoressico sulla via intracellulare LepR-JAK2-STAT3 differenziando le due subregioni dell'ippocampo: l’ippocampo dorsale (dHip) e l’ippocampo ventrale (vHip). Nel dHip, principalmente coinvolto nel controllo delle funzioni cognitive, tra cui la memoria, l'apprendimento e il riconoscimento spaziale, la combinazione di restrizione alimentare e intensa attività fisica ha significativamente ridotto l’attivazione della via di segnalazione della leptina. Questa alterazione è risultata concomitante all'aumento dei meccanismi autofagici nella fase acuta della patologia e all’aumento della attivazione della via pro-apoptotica a seguito del ripristino del peso corporeo. Questi effetti sono in grado di influenzare e alterare l'elaborazione delle informazioni intracellulari, causando un'alterazione persistente delle funzioni cognitive osservate nel test di riconoscimento spaziale SOOR. Invece, nel vHip, subregione principalmente associata alla modulazione degli stati affettivi, delle esperienze emotive e dello stress, il fenotipo anoressico ha indotto un passaggio da un'iper- a un'ipo- attivazione della via di segnalazione della leptina tra la fase acuta e il recupero del peso corporeo, con conseguente alterata modulazione dell'espressione di geni dipendenti da STAT3 e coinvolti nell'organizzazione strutturale della sinapsi eccitatoria. In aggiunta a ciò, nella fase acuta della patologia, le ratte ABA hanno mostrato una ridotta densità delle spine dendritiche in parallelo ad una ridotta percentuale di spine mature, che, insieme a livelli ridotti di PSD95 e Neuroligin-1, indicano una riorganizzazione delle strutture sinaptiche ippocampali. In concomitanza con questa alterazione strutturale, abbiamo osservato un aumento della localizzazione delle subunità dei recettori NMDA e AMPA sia nella densità post-sinaptica che nella frazione extra-sinaptica. La riorganizzazione strutturale e molecolare della sinapsi eccitatoria, potenziale indice di aumento della trasmissione glutammatergica nonostante il ridotto numero di sinapsi, potrebbe comportare lo sviluppo di fenomeni di eccitotossicità e di destabilizzazione sinaptica, compromettendo quindi i processi di plasticità sinaptica anche a seguito del recupero del peso corporeo. In conclusione, i risultati ottenuti indicano che la modulazione della via di segnalazione della leptina ha un ruolo cruciale alla base dei comportamenti disregolati tipici delle pazienti anoressiche, suggerendo il coinvolgimento in questi processi di un alterato asse di comunicazione periferia-cervello. In parallelo al coinvolgimento della via di segnalazione intracellulare della leptina, l’ulteriore coinvolgimento dei meccanismi dopaminergici, autofagici e glutammatergici mette in evidenza la complessa interazione tra questi sistemi, suggerendo il loro contributo nell'alterazione dei meccanismi di ricompensa legati all'assunzione di cibo e all'iperattività nonché nelle disfunzioni cognitive, osservate anche nelle pazienti con AN. Complessivamente, queste alterazioni molecolari, originariamente attuate dall’organismo per adattarsi alla perdita di peso corporeo, si trasformano in alterazioni maladattative persistenti che potrebbero innescare, almeno in parte, una reiterazione dei comportamenti aberranti tipici delle pazienti anoressiche e una crescente vulnerabilità allo sviluppo di altri sintomi psichiatrici concomitanti e di fenomeni di ricaduta.