Studying alterations of Ca2+ homeostasis in in vitro cell models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa fatale caratterizzata dalla morte selettiva dei motoneuroni (MN). Il meccanismo principe a cui è dovuto il danno neuronale è sconosciuto e non esiste un trattamento efficace per la cura di questa terribile malattia. In molti casi la SLA si sviluppa in maniera sporadica mentre nel 10% dei casi presenta una caratteristica genetica. Circa il 20% di questi casi famigliari sono causati da una mutazione nel gene della superossido dismutasi 1 (SOD1). In particolare, topi transgenici (Tg) esprimenti la mutazione SOD1 (G93A), correlata alla SLA, sviluppano un fenotipo molto simile a quello umano. Recenti ricerche hanno constatato come la proteina SOD1 mutata sia in grado di alterare l’omeostasi del calcio nei motoneuroni e negli astrociti limitrofi, rendendo le cellule neuronali particolarmente vulnerabili all’attivazione di un insieme di meccanismi possibilmente tossici. Considerando un tale stato dell’arte il nostro obiettivo, in questo progetto, è quello di confrontare flussi locali dello ione Ca2+ in motoneuroni e astrociti primari derivanti dal midollo spinale di topi SOD1(G93A) e SOD1(WT). A questo scopo applicheremo due differenti approcci: 1. analisi dei flussi locali di Ca2+ in motoneuroni primari: i) abbiamo ottimizzate le condizioni di estrazione e messa in coltura di motoneuroni primari dal midollo spinale di topi Tg; ii) abbiamo ingegnerizzato e prodotto vettori virali adeno associati (AAV) per l’espressione delle sonde Ca2+ cameleon indirizzate a differenti compartimenti cellulari e sotto il controllo di un promotore motoneurone-specifico (derivato Hb9); iii) abbiamo testato funzionalmente e usato con successo le sonde per la misurazione delle variazioni di Ca2+ in MN spinali primari, dimostrando una espressione specifica della sonda nei MN e un alterato (incrementato) ingresso di Ca2+ nel citosol dopo stimolazione con AMPA nei MN SOD1(G93A) messi a confronto con il controllo. Abbiamo inoltre dimostrato che queste sonde possono essere espresse in vivo in MN del midollo spinale attraverso una somministrazione sistemica a topi neonati. 2. Analisi dei flussi locali di Ca2+ e dei relativi parametri in astrociti spinali primari Considerando il noto effetto di cross-talk degli astrociti sui motoneuroni nel progredire della malattia in topi con fenotipo SLA, abbiamo intrapreso una analisi comparativa dei flussi locali di Ca2+ in astrociti spinali primari derivanti da topi SOD1(G93A) e SOD1(WT). Al fine di determinare se la mutazione G93A fosse in grado di causare una variazione dell’omeostasi del Ca2+ si è proceduto nel seguente modo: i) inizialmente abbiamo settato le condizione per l’espressione in astrociti spinali primari di sonde Ca2+ indirizzate a specifici compartimenti cellulari; (ii) successivamente ci siamo focalizzati sulle misure di calcio fornendo la prova della presenza di flussi alterati di calcio in differenti domini cellulari di astrociti SOD1(G93A) dopo stimolazione del SOCE o recettori purinergici; (iii) nel tentativo di ipotizzare un possibile pathway che spiegasse la fenomenologia osservata abbiamo intrapreso una analisi comparativa (attraverso tecniche classiche di biochimica e immunocitochimica), in astrociti spinali primari SOD1(WT) e SOD1(G93A), dell’espressione dei principali sistemi di trasporto dello ione Ca2+ e di altri parametri correlati. Concludendo i nostri dati enfatizzano che l’espressione di SOD1(G93A) è strettamente correlata con una omeostasi alterata dello ione Ca2+ in astrociti derivanti da midollo spinale, tutto ciò avvalora ulteriormente l’ipotesi di un cross-talk letale tra astrociti e motoneuroni attraverso un meccanismo Ca2+ dipendente.