NEUTRALIZING ACTIVITY AGAINST SARS-COV-2 OF HUMAN BREAST MILK FROM COVID-19 POSITIVE AND NEGATIVE LACTATING MOTHERS

Nutrition plays a fundamental role in human health, even more so for the paediatric and neonatal populations. Breast milk is undoubtedly the best food for newborns, both for the benefits due to its nutritional content and for the presence of numerous functional and bioactive substances. The bioactive substances present in breast milk perform several functions that promote the short- and long-term health of the newborn. Among the important functional properties of human milk, its marked antimicrobial and, in particular, antiviral activity has a paramount role. The SARS-CoV-2 pandemic, the pathogen behind COVID-19, in its dramatic nature, was the cue for global scientific research to rediscover and test compounds with presumed, or proven, antiviral activity. The presence of a considerable amount of these antiviral compounds in breast milk would explain its non- specific antiviral activity against many viruses, including SARS-CoV-2. Given these premises, a study was conducted to investigate the non-specific antiviral activity of breast milk, thus independent of the presence of antibodies, against SARS-CoV-2. Breast milk samples were collected from mothers with a positive nasopharyngeal swab for the presence of the virus (group A) and from mothers with a negative nasopharyngeal swab, not vaccinated against the virus and with a negative history of COVID-19 infection. Samples were collected at the following timepoints: 2 days postpartum (T0, colostrum), 7 days postpartum (T1, transitional milk), and 20 days postpartum (T2, mature milk). The collected samples were then analysed to assess NT50 microneutralization according to the Reed and Muench method. The neutralisation assay analysed the cytopathic effect caused by viral replication in a population of VERO cells placed in culture, incubated with breast milk samples, and infected with SARS-CoV-2. To assess the presence of antibody activity possibly responsible for the neutralisation, samples from both groups A and B were tested with ELISA kits for antibodies directed against SARS-CoV-2. The results confirmed the ability of samples from positive mothers (group A) to neutralise the virus, with a decreasing effect from T0 to T2. ELISA tests on these samples showed a direct correlation between the antibody titre present in the sample and the neutralising capacity of the sample. As for group B, mothers seronegative for the virus, samples also showed neutralising activity, decreasing at time points, without a direct correlation between neutralising capacity and antibody titre in the sample. The presence of a certain antibody titre also in the samples of group B mothers is primarily attributable to the presence of secretory immunoglobulin A with cross-reactivity against SARS-CoV-2, a finding already described in the literature, but without a correlation between titre and neutralising capacity. The results of this study therefore demonstrate that breast milk possesses compounds, other than antibodies, capable of neutralising the SARS-CoV-2 virus, with the effect being more pronounced in colostrum and less evident in mature milk. Preliminary tests were also conducted on the same samples to assess the nature of the compounds responsible for this effect. Preliminary results showed a direct correlation between the neutralising capacity of the sample and the amount of eicosatrienoic acid (20:3 ω-9), the possible antiviral effect of which has not yet been described in the literature. In addition, pilot tests following the study showed an increasing neutralising effect of increasing concentrations of oligosaccharides in breast milk (from 0.12 mg/dL to 0.5 mg/dL), which are more represented in colostrum than in mature milk. In conclusion, breast milk has an innate antiviral capacity, exerted independently of the specific antibodies. Future studies are needed to understand which compound, or synergy of compounds, may be responsible for this effect.

L'alimentazione svolge un ruolo fondamentale per la salute umana, soprattutto nella popolazione pediatrica e neonatale. Il latte materno è senza dubbio l'alimento migliore per i neonati, sia per i benefici dovuti al suo contenuto nutrizionale sia per la presenza di numerose sostanze funzionali e bioattive. Le sostanze bioattive presenti nel latte materno svolgono diverse funzioni che promuovono la salute del neonato sia a breve che a lungo termine. Tra le importanti proprietà funzionali del latte umano vi è la sua spiccata attività antimicrobica e, in particolare, antivirale. La pandemia di SARS-CoV-2, l'agente patogeno alla base della COVID-19, nella sua drammaticità, è stata lo spunto per la ricerca scientifica globale, per rivalutare e testare composti con presunta o comprovata attività antivirale. La presenza di una quantità considerevole di questi composti antivirali nel latte materno spiegherebbe la sua attività antivirale non specifica nei confronti di molti virus, tra cui il SARS-CoV-2. Date queste premesse, è stato condotto uno studio per indagare l'attività antivirale non specifica del latte materno, nei confronti del SARS-CoV-2. Sono stati raccolti campioni di latte materno da madri con tampone nasofaringeo positivo per la presenza del virus (gruppo A) e da madri con tampone nasofaringeo negativo, non vaccinate contro il virus e con anamnesi negativa per l'infezione COVID-19. I campioni sono stati raccolti nei seguenti timepoints: 2 giorni dopo il parto (T0, colostro), 7 giorni dopo il parto (T1, latte di transizione) e 20 giorni dopo il parto (T2, latte maturo). I campioni raccolti sono stati poi analizzati per valutare la microneutralizzazione NT50 secondo il metodo di Reed e Muench. Il saggio di neutralizzazione ha analizzato l'effetto citopatico causato dalla replicazione virale in una popolazione di cellule VERO poste in coltura, incubate con i campioni di latte materno e infettate con SARS-CoV-2. Per valutare la presenza di attività anticorpale eventualmente responsabile della neutralizzazione, i campioni di entrambi i gruppi A e B sono stati analizzati con kit ELISA per la ricerca di anticorpi diretti conto SARS-CoV-2. I risultati hanno confermato la capacità dei campioni provenienti da madri positive (gruppo A) di neutralizzare il virus, con effetto decrescente da T0 a T2. I test ELISA su questi campioni hanno mostrato una diretta correlazione tra il titolo anticorpale presente nel campione e la capacità neutralizzante dello stesso. Per quanto riguarda il gruppo B, madri sieronegative per il virus, anche i campioni di questo gruppo hanno mostrato una attività neutralizzante, sempre decrescente nei vari timepoints, senza una diretta correlazione tra capacità neutralizzante e titolo anticorpale nel campione. La presenza di un certo titolo anticorpale anche nei campioni delle madri del gruppo B è da ascriversi alla presenza di Immunoglobuline A secretorie con cross-reattività nei confronti di SARS-CoV-2, dato già descritto in letteratura, tuttavia senza una correlazione tra titolo e capacità di neutralizzazione. I risultati di questo studio dimostrano quindi che il latte materno possiede composti, diversi dagli anticorpi, in grado di neutralizzare il virus SARS-CoV-2, con effetto più spiccato nel colostro e meno evidente nel latte maturo. Sono stati inoltre condotti alcuni test preliminari sugli stessi campioni per valutare la natura dei composti responsabili di questo effetto. I risultati preliminari hanno mostrato una diretta correlazione tra capacità neutralizzante del campione e la quantità di acido eicosatrienoico (20:3 ω-9) il cui eventuale effetto antivirale non è ancora stato descritto in letteratura. Inoltre, test pilota successivi allo studio hanno dimostrato un effetto neutralizzante crescente di concentrazioni crescenti di oligosaccaridi del latte materno (da 0,12 mg/dL a 0,5 mg/dL), maggiormente rappresentati nel colostro che nel latte maturo. Concludendo, il latte materno ha una capacità antivirale innata e indipendente dagli anticorpi specifici presenti. La prosecuzione della ricerca scientifica in questa direzione è necessaria per comprendere quale composto, o sinergia di composti, possa essere responsabile di questo effetto.