Nel sistema nervoso centrale (SNC), le cellule gliali in condizioni fisiologiche producono e rilasciano sostanze protettive come molecole anti-ossidanti e fattori neurotrofici (Sofroniew et al., 2010). Tutti gli eventi che alterano l’equilibrio omeostatico inducono una risposta infiammatoria locale (Carson et al., 2006). La glia reattiva partecipa producendo mediatori dell’infiammazione come chemochine, citochine, purine e radicali liberi. I recettori Toll-like (TLRs) sono coinvolti nelle risposte da danno indotto a carico del tessuto nervoso e nel dolore neuropatico. Nel nostro studio abbiamo investigato i meccanismi di comunicazione tra le cellule della glia attraverso la realizzazione di un modello cellulare in vitro idoneo alla valutazione della risposta gliale al trattamento con agonisti dei TLRs, valutando sia l’espressione di molecole associate all’attivazione dei recettori sia la modulazione genica/proteica degli stessi TLRs. Per poter valutare meglio la genesi e la progressione dello stato infiammatorio, colture di microglia purificata e colture arricchite in astrociti (≥95%) sono state ottenute dal sacrificio di ratti neonati di 2 giorni e dalla successiva dissezione corticale. Per i nostri esperimenti le colture arricchite di astrociti sono state trattate con L-leucil-L-Leucina estere metilico (L-LME) al fine di ottenere una coltura purificata di astrociti (≥99%). L’attivazione della microglia e degli astrociti (± L-LME) è stata indotta dal trattamento con lipopolisaccaride (LPS, agonista del TLR4), zymosan (agonista del TLR2) e poli(I:C) (agonista del TLR3) per 6 e 24 ore. L’analisi dell’espressione genica (in Real Time PCR) ha permesso di dimostrare la capacità delle cellule della glia di indurre la trascrizione di mRNA codificante per interleuchina-1β (IL-1β), interleuchina-6 (IL-6) e tumor necrosis factor-α (TNF-α). La coltura purificata di astrociti non risponde al trattamento con agonisti TLRs, diversamente dalla coltura arricchita in astrociti in cui persiste una piccola percentuale di cellule della microglia. La produzione e il rilascio nel terreno di coltura di mediatori dell’infiammazione (dosaggio ELISA) confermano che la microglia risponde allo stimolo patogenico. Inoltre le analisi di citofluorimetria hanno permesso di valutare l’espressione dei TLRs sulla membrana cellulare (TLR2/4) e sulla membrana degli endosomi (TLR3) dopo 1 ora, 6 ore e 24 ore di trattamento. La responsività delle cellule non-neuronali ad uno stimolo lesivo viene solitamente valutata sulla base della capacità delle cellule di produrre mediatori pro-infiammatori. Alla luce di queste evidenze abbiamo voluto chiarire se l’apparente assenza di responsività della coltura purificata di astrociti, dipendesse da alterazioni a carico della struttura recettoriale. Utilizzando la microscopia confocale, abbiamo marcato le cellule con LPS coniugato con un fluorocromo dimostrando la presenza del TLR4 sulla superficie cellulare degli astrociti e le analisi di Western Blot hanno permesso di confermare anche la presenza dei co-recettori CD14 e MD2. In particolare, lo studio sugli astrociti purificati è stato approfondito mediante citofluorimetria per valutare le alterazioni a carico dell’espressione proteica dei TLRs. Un’ulteriore batteria di esperimenti è stata condotta ripristinando il profilo infiammatorio aggiungendo un numero fisso di cellule di microglia (per un totale del 10% di cellule contaminanti) ad una coltura purificata di astrociti. Sebbene la ri-aggiunta di microglia su un monostrato di astrociti purificati (≥99%) ripristini il profilo infiammatorio della coltura, in termini di valore assoluto la quantità di citochine prodotte e rilasciate è comunque inferiore ai valori misurati nella coltura arricchita in astrociti (in cui la contaminante microgliale è ≤5%). Per meglio chiarire se l’attivazione microgliale in presenza di astrociti dipendesse da il contatto fisico tra le membrane cellulari oppure da fattori chimici abbiamo allestito un sistema “Transwell”. Il paradigma descritto della co-coltura astrociti/microglia protrebbe rappresentare un utile punto di partenza per chiarire i meccanismi molecolari che sottendono le specifiche risposte delle singole popolazioni cellulari all’infiammazione, non solo del SNC, specialmente in tutti quei meccanismi che prevedono il coinvolgimento dei recettori TLRs.
Toll-like receptors as transducer of inflammatory signals in glia: the astrocyte-microglia connection
MARINELLI, CARLA
2015
Abstract
Nel sistema nervoso centrale (SNC), le cellule gliali in condizioni fisiologiche producono e rilasciano sostanze protettive come molecole anti-ossidanti e fattori neurotrofici (Sofroniew et al., 2010). Tutti gli eventi che alterano l’equilibrio omeostatico inducono una risposta infiammatoria locale (Carson et al., 2006). La glia reattiva partecipa producendo mediatori dell’infiammazione come chemochine, citochine, purine e radicali liberi. I recettori Toll-like (TLRs) sono coinvolti nelle risposte da danno indotto a carico del tessuto nervoso e nel dolore neuropatico. Nel nostro studio abbiamo investigato i meccanismi di comunicazione tra le cellule della glia attraverso la realizzazione di un modello cellulare in vitro idoneo alla valutazione della risposta gliale al trattamento con agonisti dei TLRs, valutando sia l’espressione di molecole associate all’attivazione dei recettori sia la modulazione genica/proteica degli stessi TLRs. Per poter valutare meglio la genesi e la progressione dello stato infiammatorio, colture di microglia purificata e colture arricchite in astrociti (≥95%) sono state ottenute dal sacrificio di ratti neonati di 2 giorni e dalla successiva dissezione corticale. Per i nostri esperimenti le colture arricchite di astrociti sono state trattate con L-leucil-L-Leucina estere metilico (L-LME) al fine di ottenere una coltura purificata di astrociti (≥99%). L’attivazione della microglia e degli astrociti (± L-LME) è stata indotta dal trattamento con lipopolisaccaride (LPS, agonista del TLR4), zymosan (agonista del TLR2) e poli(I:C) (agonista del TLR3) per 6 e 24 ore. L’analisi dell’espressione genica (in Real Time PCR) ha permesso di dimostrare la capacità delle cellule della glia di indurre la trascrizione di mRNA codificante per interleuchina-1β (IL-1β), interleuchina-6 (IL-6) e tumor necrosis factor-α (TNF-α). La coltura purificata di astrociti non risponde al trattamento con agonisti TLRs, diversamente dalla coltura arricchita in astrociti in cui persiste una piccola percentuale di cellule della microglia. La produzione e il rilascio nel terreno di coltura di mediatori dell’infiammazione (dosaggio ELISA) confermano che la microglia risponde allo stimolo patogenico. Inoltre le analisi di citofluorimetria hanno permesso di valutare l’espressione dei TLRs sulla membrana cellulare (TLR2/4) e sulla membrana degli endosomi (TLR3) dopo 1 ora, 6 ore e 24 ore di trattamento. La responsività delle cellule non-neuronali ad uno stimolo lesivo viene solitamente valutata sulla base della capacità delle cellule di produrre mediatori pro-infiammatori. Alla luce di queste evidenze abbiamo voluto chiarire se l’apparente assenza di responsività della coltura purificata di astrociti, dipendesse da alterazioni a carico della struttura recettoriale. Utilizzando la microscopia confocale, abbiamo marcato le cellule con LPS coniugato con un fluorocromo dimostrando la presenza del TLR4 sulla superficie cellulare degli astrociti e le analisi di Western Blot hanno permesso di confermare anche la presenza dei co-recettori CD14 e MD2. In particolare, lo studio sugli astrociti purificati è stato approfondito mediante citofluorimetria per valutare le alterazioni a carico dell’espressione proteica dei TLRs. Un’ulteriore batteria di esperimenti è stata condotta ripristinando il profilo infiammatorio aggiungendo un numero fisso di cellule di microglia (per un totale del 10% di cellule contaminanti) ad una coltura purificata di astrociti. Sebbene la ri-aggiunta di microglia su un monostrato di astrociti purificati (≥99%) ripristini il profilo infiammatorio della coltura, in termini di valore assoluto la quantità di citochine prodotte e rilasciate è comunque inferiore ai valori misurati nella coltura arricchita in astrociti (in cui la contaminante microgliale è ≤5%). Per meglio chiarire se l’attivazione microgliale in presenza di astrociti dipendesse da il contatto fisico tra le membrane cellulari oppure da fattori chimici abbiamo allestito un sistema “Transwell”. Il paradigma descritto della co-coltura astrociti/microglia protrebbe rappresentare un utile punto di partenza per chiarire i meccanismi molecolari che sottendono le specifiche risposte delle singole popolazioni cellulari all’infiammazione, non solo del SNC, specialmente in tutti quei meccanismi che prevedono il coinvolgimento dei recettori TLRs.File | Dimensione | Formato | |
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https://hdl.handle.net/20.500.14242/84943
URN:NBN:IT:UNIPD-84943