Fabrication and characterization of spiral phase masks for super-resolution

La microscopia confocale, con la sua alta risoluzione laterale e assiale, ha permesso l'osservazione delle dinamiche interne delle cellule e dei tessuti in modo dettagliato. La profondità alla quale è possibile osservare i campioni, però, è fortemente limitata dalla diffusione e dall'assorbimento subiti dalla luce, inoltre la risoluzione sul piano focale è limitata ad un'area di grandezza paragonabile alla lunghezza d'onda utilizzata, a causa della diffrazione. È possibile raggiungere profondità di centinaia di µm usando la microscopia nonlineare, basata sull'interazione tra il tessuto e più fotoni infrarossi, che subiscono molto di meno gli effetti della diffusione e dell'assorbimento nel tessuto. Risoluzioni di poche decine di nanometri possono inoltre essere ottenute grazie alla microscopia STED, un miglioramento della modalità confocale. Nell'ultimo decennio, sono stati sviluppati microscopi STED con eccitazione a due fotoni (TPE-STED), in modo da combinare queste due proprietà, con risoluzioni che a profondità di decine di micron arrivano fino a valori 4-5 volte migliori dei sistemi limitati dalla diffrazione. Ciononostante, la diffusione e l'assorbimento del fascio di deplezione limitano la profondità alla quale poter ancora osservare dettagli super-risolti a non più di un centinaio di micron. Lo scopo di questa tesi è stato lo sviluppo del primo microscopio TPE-STED con eccitazione nel range [1000-1500] nm e lunghezze d'onda di deplezione vicine agli 800 nm, in modo da poter sorpassare il limite di profondità degli attuali microscopi STED. In questo regime, sono necessari fluorofori adatti, e per questo abbiamo testato la performance delle molecole ATTO 594, ATTO 647N e mGarnet2. In parallelo, abbiamo usato il sistema a due fasci della piattaforma per fornire simultaneamente imaging nonlineare con assorbimento degenere e nondegenere di fotoni a diverse lunghezze d'onda. Una parte consistente del lavoro di tesi è stato anche concentrato sullo sviluppo di un protocollo di fabbricazione e caratterizzazione di elementi ottici per la manipolazione del fascio STED. Lo sforzo è stato compiuto con l'intenzione di poter abbinare liberamente ogni fluoroforo selezionato con la lunghezza di deplezione più efficiente, senza dover attendere i lunghi tempi necessari per la richiesta di soluzioni commerciali.