A transcriptomic approach to dissect the effect of grapevine rootstocks on plant tolerance to abiotic stresses and berry ripening

La vite (genere Vitis) rappresenta una delle principali specie coltivate su scala mondiale , con una produzione che si avvicina ai 70 milioni di tonnellate e una superficie coltivata di oltre 7 milioni di ettari . Tra le 60 specie all'interno del genere Vitis, Vitis vinifera L. è la più utilizzata per la produzione di vino e distillati. Prima della devastazione della viticoltura europea causata dall'introduzione del parassita fillossera dal Nord America, le varietà di V. vinifera usate per la produzione di vino in Europa non erano innestate. Successivamente, l'utilizzo di portinnesti di origine americana ha permesso di fornire una maggiore resistenza al parassita e ad altre malattie che stavano seriamente compromettendo la viticolture Europea. I portinnesti più usati commercialmente derivano da incroci di svariate specie di vite, tra cui V. berlandieri, V. riparia e V. rupestris, e, oltre a migliorare la resistenza alla fillossera e altri patogeni, conferiscono caratteristiche di tolleranza a stress abiotici (come siccità, elevata salinità e Fe-carenza), regolano la crescita dell’acino, contribuiscono alla maturazione e alla qualità dei frutti, possono alterare alcuni aspetti legati alla qualità in post-raccolta dell’acino. I risultati presentati in questa tesi di dottorato sono parte integrante di un progetto multi- disciplinare chiamato SERRES (selezione di nuovi portinnesti di vite resistenti a stress abiotici attraverso lo sviluppo e la validazione di marcatori molecolari) e finanziato dalla fondazione Ager. La selezione e la caratterizzazione di portainnesti che conferiscano un maggiore grado di tolleranza agli stress abiotici è essenziale per lo sviluppo di modelli agricoli sostenibili e, allo stesso tempo, per l’induzione di un rapporto equilibrato tra fase vegetativa e produttiva, una progressione diversa della maturazione dell’uva, così come, differenze a livello qualitativo. Migliorare la conoscenza delle basi molecolari, biochimiche e fisiologiche della resistenza allo stress è un requisito fondamentale per la selezione di genotipi in grado di far fronte alle condizioni di stress senza conseguenze negative su crescita vegetativa e produzione di uva ad alta qualità. Lo stress idrico ha un impatto enorme sulla produzione agricola, infatti, è uno dei principali fattori che limitano la produttività delle piante e causano una grave riduzione della resa. Sulla base dei modelli climatici globali, che prevedono un aumento delle aree aride nel prossimo futuro, la carenza idrica può diventare il principale fattore limitante per la coltivazione. In questo contesto, i portinnesti potrebbero assumere un ruolo importante nel limitare la perdita di raccolto migliorando l'efficienza dell'uso dell'acqua, il potenziale di sopravvivenza della pianta e la capacità di crescita del frutto in presenza di condizioni avverse come siccità ed elevata salinità del suolo (stress osmotici). Lo stress idrico porta a molti cambiamenti morfologici e fisiologici, tra cui ridotta espansione della parte aerea, limitazione della crescita radicale, diminuzione della traspirazione fogliare e dell’efficienza fotosintetica, accumulo di ioni e osmoliti, attivazione di processi di disintossicazione e parallelamente la regolazione a livello trascrizionale di un elevato numero di geni. In seguito allo stress idrico, si innesca uno stress secondario legato all’accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS), quali H2O2, O2-, -OH, 1O2 e NO. Le ROS sono responsabili della maggior parte dei danni ossidativi nei sistemi biologici e nelle componenti cellulari. Un rigoroso controllo dei livelli delle ROS è obbligatorio per la sopravvivenza delle piante e il cross-talk tra l’accumulo di ROS lo stato redox è parte integrante di un preciso controllo omeostatico che gioca un ruolo fondamentale nella risposta agli stress. Le piante innescano svariati meccanismi di riduzione del livello di ROS (ROS-scavenging) volti all’induzione dell’espressione di geni che codificano per gli enzimi superossido dismutasi (SOD) , catalasi (CAT), ascorbato perossidasi e glutatione perossidasi. Recentemente è stato condotto uno studio di caratterizzazione a livello biochimico e fisiologico di M4 [(V. vinifera x V. Berlandieri) x V. berlandieri cv Resseguier n.1], un nuovo genotipo di vite candidato ad essere utilizzato come portinnesto. Questo genotipo, studiato dal 1985 dal gruppo di ricerca DiSAA dell'Università degli studi di Milano, è stato selezionato per la sua alta tolleranza allo stress idrico (WS) e salino (SS). Se confrontate con il genotipo commerciale 101.14, le piante di M4 sottoposte a deficit idrico hanno mostrato una maggiore capacità di tolleranza e una più elevata attività fotosintetica anche in condizioni di stress gravi. Nella prima parte di questa tesi sono stati osservati i risultati ottenuti da un’analisi trascrittomica condotta su larga scala (RNA -Seq), effettuata su foglie e radici dei portinnesti M4 e 101.14 campionati in condizioni di stress idrico progressivo (5 time-points). Le analisi fisiologiche sono state effettuate sulle piante trattate (deficit idrico, WS) e di controllo (irrigate, WW) lungo tutto il campionamento. L'analisi multifattoriale, che è stata condotta sui dati mRNA-Seq, ci ha permesso di valutare il peso di tre diverse componenti sulla risposta allo stress: genotipo ( R : 101.14 e M4 ), tipo di stress imposto (Trattamento, T : WW e WS) e time-point considerato ( P : T1 - T4 ). Con questa analisi stato inoltre possibile identificare i geni differenzialmente espressi (GDE) legati all’azione specifica o combinata di questi fattori (R:T , R:P , T:P e R:T:P). In WS radice si è sempre osservati un numero maggiore di GDE rispetto alla foglia. Una prima osservazione generale confrontando i risultati delle analisi multifattoriali eseguite su foglie e radici, è che nel tessuto radice il "trattamento" sembra essere la variabile che ha un impatto maggiore sull’espressione genica, mentre nel tessuto fogliare il peso del genotipo (portinnesto) sembra essere il più elevato. Questa osservazione non è sorprendente, considerato che il sistema radicale è il primo organo a percepire lo stress causato dalla carenza idrica e quello principale atto alla risposta. In questo caso è chiaro che il tipo di trattamento imposto rappresenta la variabile principale che influenza l’espressione genica mentre l'effetto del genotipo è meno determinante. Con i dati RNA-seq è stata eseguita una “Differential Cluster Analysis” (DCA), che si basa sul confronto delle correlazioni tra le espressioni dei trascritti di un organismo “reference” e di un “target”. Questa analisi ci ha permesso di identificare i pattern di co-espressione genica (T1-T4) conservati e pattern non-conservati tra M4 e 101.14. Per quanto riguarda gli ormoni vegetali, è stata osservata un’induzione dei geni legati ad auxine, jasmonati ed etilene nelle radici di M4 sottoposte a stress, mentre una sovra-regolazione degli stessi trascritti è stata osservata in 101.14. La categoria metabolica più interessante, emersa dall’analisi DCA, è quella legata ai metaboliti secondari. Infatti sono stati individuati diversi GDE legati a questa categoria sia in radice che in foglia di M4, indotti in condizioni di stress, ed è stata evidenziata una forte specificità di espressione tra i due tessuti. Infatti, in condizioni di carenza idrica, radici e foglie del genotipo tollerante M4 mostrano rispettivamente una maggiore induzione dei geni legati agli stilbeni (i.e. STS) e ai flavonoidi (e.g. CHS, F3H, LDOX, FLS). Il ruolo di questi geni potrebbe essere legato al controllo e al bilanciamento delle specie reattive dell’ossigeno (ROS), in aggiunta ai classici meccanismi di ROS-scaveging (meccanismi antiossidanti primari). In presenza di stress idrico, M4 potrebbe attuare meccanismi differenziali in radice e foglie che portano alla produzione di molecole, come resveratrolo e flavonoidi, correlate ad un sistema antiossidante secondario presente solo nel portinnesto più tollerante. La maggiore tolleranza allo stress idrico di M4, in confronto a quanto osservato in 101.14, potrebbe essere relativo a questi eventi. Nella seconda parte di questa tesi, è stato valutato l’effetto dei portinnesti M4 e 1103P su sviluppo, maturazione e qualità delle bacche di Cabernet Sauvignon (CS). Per questo esperimento sono stati campionati da piante di CS/M4 e CS/1103P acini interi a 45, 59 e 65 giorni dopo la piena fioritura (GDF). Successivamente la maggior parte delle bacche di CS/M4 avevano raggiunto l’invaiatura, si è quindi deciso di separare bucce e polpe per i campionamenti successivi, condotti a 72, 86 e 100 GDF. Sulla base dei parametri fisici (volume e colore) e chimici (solidi solubili totali, SSC), i due portinnesti hanno mostrato una diversa influenza sulla cinetica di sviluppo e maturazione delle bacche di CS. Per identificare le stesse fasi di sviluppo dei frutti raccolti da CS/1103P e CS/M4, è stato condotta un’analisi di espressione preliminare, mediante sistema real-time PCR, sui geni coinvolti nella biosintesi di fenoli, zuccheri e acidi organici. Questo approccio ha permesso di identificare la fase verde a 45 DAFB in entrambe le combinazioni d’innesto, mentre l’invaiatura è stata individuata a 72 e 86 DAFB rispettivamente per CS/M4 e CS/1103P. Le analisi mRNA-seq e micro-RNAseq sono state effettuate sulle bacche in fase di pre-invaiatura (45 GDF), invaiatura (72 GDF per CS/M4 e 86 GDF per CS/1103P) e epoca di raccolta tradizionale di CS (100 GDF). Le analisi statistiche sono state condotte sui dati RNA-seq confrontando il rapporto tra i dati di espressione di CS/M4 e CS/1103P ad ogni punto della cinetica e per entrambi i tessuti. Le analisi di “clusterizzazione” e di arricchimento hanno evidenziato la presenta di un elevato numero di GDE legati a metabolismi auxinici. Le auxine hanno un ruolo fondamentale durante lo sviluppo e sulla maturazione della bacca, si è quindi deciso di concentrare la nostra attenzione su questa classe ormonale e di eseguire una caratterizzazione e un’analsi filogenetica delle famiglie geniche ARF e AUX / IAA sul genoma di PN40024. Il ruolo delle auxine in questi processi è stato studiato anche in un altro un altro lavoro presentato in questa tesi, durante il quale è stato dimostrato che un trattamento sugli acini d’uva in fase di pre-invaiatura con l’auxina sintetica NAA causa un ritardo nella maturazione, che si manifesta a livello fisiologico e di espressione genica, parallelamente alle quali è stata osservata l’induzione di un elevato numero di trascritti atti a controllare l’omeostasi delle auxine. Le analisi condotte con il software HORMONOMETER hanno suggerito che il recupero omeostatico atto a portare i livelli dell’ormone a concentrazioni meno elevate è avvenuto a soli 7 giorni dal trattamento. Questa ipotesi è fortemente supportata dalla sovra-regolazione di geni coinvolti nella coniugazione (GH3 -like) e nell'azione ( IAA4 e IAA31 -like) delle auxine. Considerando questi risultati, le differenze osservate tra CS/M4 e CS/1103P durante lo sviluppo e la maturazione della bacca potrebbero essere collegate ad una diversa regolazione dell’auxina. Infatti, i dati di espressione (mRNA-seq, microRNA-seq e qPCR) evidenziato importanti differenze nel metabolismo auxinico tra le due combinazioni d’innesto. I nostri dati suggeriscono un coinvolgimento importante dell’ormone nel controllo dello sviluppo/maturazione della bacca grazie all’espressione di legati, da un lato all’azione delle auxine (ARF e AUX/IAA) e, dall'altro , all’omeostasi di questo ormone attraverso trascritti coinvolti nella coniugazione (GH3) e nel trasporto (PIN e ABCB). In questo contesto , anche i miRNA hanno un ruolo importante, in particolare esercitando un controllo sulla trascrizione dei geni ARF (e.g. miR160 e miR167). In fase di pre-invaiatura, le auxine hanno un’azione positiva sulla trascrizione dei geni che controllano le dimensioni della bacca (e.g. espansine) e di geni legati alla famiglia delle ARF (ad esempio VvARF8A e VvARF1A ). Parallelamente all'induzione di geni che appartengono alla famiglia ARF, è stata osservata l’induzione di trascritti che controllano i livelli (e.g. VvGH3-1) e l'azione (VvIAA9, VvIAA15A, VvIAA16) dell’ormone, suggerendo un’accurata regolazione dei livelli auxinici in queste fasi importanti dello sviluppo del frutto. Inoltre, il controllo dei livelli di auxina nella bacca d’uva sembra essere legato anche ad altri meccanismi legati all’induzione di geni legati al trasporto ormonale durante le fasi precoci (ABCBs) e tardive (PIN) della maturazione del frutto. Tenendo conto delle differenze osservate tra CS/M4 e CS/1103P nell’espressione di trascritti legati al metabolismo dell’auxina, questo ormone sembra esercitare un’azione negativa su alcuni geni legati alla maturazione della bacca (e.g. flavonoidi), ma la sua induzione nella fase di pre-invaiatura potrebbe essere necessaria per far scattare altri processi metabolici coinvolti nella maturazione dell’acino d’uva.