Genomic approach to Idiopathic Calcium Nephrolithiasis: searching for susceptibility genes in a three generation family

La nefrolitiasi calcica idiopatica (NCI) è una malattia multifattoriale, la cui patogenesi dipende dall’interazione di fattori ambientali, metabolici, anatomici e genetici. L’importanza dei fattori ereditari è emersa da diversi studi su famiglie e gemelli affetti da NCI. Il modello di ereditarietà più probabile sembrerebbe, come predetto da programmi bioinformatica, ad eredità monogenica co-dominante o poligenica. La maggior parte degli studi a gene candidato o di associazione condotti fin ora ha prodotto risultati negativi o marginali, lasciando pertanto le basi genetiche della NCI una questione ancora aperta. Tuttavia, le nuove tecnologie di analisi genetica sono in continua evoluzione e potrebbero contribuire ad approfondire le nostre conoscenze sulla patogenesi della NCI. Le tecnologie whole-genome scanning, quali Next-Generation Sequencing (NGS) and CGH (Comparative Genomic Hybridization) array, rappresentano gli approcci di genetica molecolare più recenti, e permettono di tracciare una mappa completa della variabilità presente nel genoma umano, in particolare SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) e varianti strutturali. Negli ultimi anni l’importanza di queste ultime, maggiormente rappresentate dalle Copy-Number Variants (CNVs), è stata infatti dimostrata in numerosi studi che ne hanno individuato un ruolo critico per lo sviluppo di malattie genetiche complesse. Scopo di questo studio è stata la ricerca di alcune delle maggiori varianti di suscettibilità alla NCI, applicando l’enorme potenziale delle tecnologie whole genome scanning ad un caso studio molto peculiare, sia per manifestazioni cliniche che per il bagkground genetico. Il probando da circa 30 anni è affetto da una forma severa di NCI, con ipercalciuria intermittente e tubulopatia fosfaturica, espellendo fino ad oggi circa 300 calcoli, sia spontaneamente che mediante litotripsia (33 interventi). Egli appartiene ad una famiglia con consanguineità, in cui la nefrolitiasi viene trasmessa in modo apparentemente dominante, con maschi affetti più severamente e meno frequentemente rispetto alle femmine. Da un’analisi CGH array, al fine di individuare la presenza di eventuali CNV, è stato possibile identificare una duplicazione di una regione di 308 Kb del cromosoma X (Xq22.2 CNV) del probando. Questa CNV è risultata particolarmente interessante poiché fin ora mai identificata e condivisa da altri tre familiari (eredità materna). Inoltre, confrontando la duplicazione Xq22.2 con un database di 14375 individui sono state identificate solo 5 duplicazioni “ overlappanti”, confermandone pertanto l’estrema rarità. In particolare, tutte queste 5 duplicazioni mostravano una regione minima comune, corrispondente al gene NUP62CL, suggerendone una possibile significatività. In uno studio di espressione da noi effettuato si è inoltre osservata una significativa e marcata down-regolazione di NUP62CL. Pertanto, pur non avendone avuto prova definitiva, è sembrato che la CNV Xq22.2 giocasse un ruolo importante nella patogenesi della NCI nella nostra famiglia. Tuttavia, data la sua presenza anche in un membro non evidentemente affetto e considerata anche la severità del fenotipo NCI di alcuni membri del ramo paterno, è stato ipotizzato che la presenza aggiuntiva di altri determinanti genetici potesse essere responsabile del fenotipo estremo riscontrato nel probando. In quest’ottica, è stato sequenziato l’intero esoma del probando (Whole Exome Sequencing) al fine di individuare varianti puntiformi rare che potessero agire da ulteriori varianti di suscettibilità alla NCI nella famiglia caso studio. La fase di analisi bioinformatica e validazione molecolare ha portato a delineare un quadro di eredità poligenica, con l’individuazione di quattro possibili geni di suscettibilità: XDH, ATP6V1B1, HNF1B, NUP62CL. Il gene XDH, fattore causativo della xanthinuria di tipo I, è stato evidenziato per la presenza di due varianti rare con un predetto effetto dannoso sulla struttura proteica. Il gene ATP6V1B1, di cui è già noto il ruolo nell’acidosi tubulare distale, presentava una variante missenso che sembrava render conto del fenotipo intermedio ipocitraturia osservato nella famiglia. E’ stata individuata, inoltre, una variante estremamente rara nel gene HNF1B, un fattore causativo di nefropatia cistica e, concordemente, il probando recentemente aveva mostrato la presenza di cisti pre-caliceali. Infine, soprendentemente, è stato possibile evidenziare ancora una volta il gene NUP62CL per la presenza di due varianti omozigoti, che agiscono attivando dei siti criptici di splicing e quindi con un probabile effetto di produzione di un mRNA aberrante. Questo gene non è stato mai associato alla NCI ma, possedendo un ruolo noto nel trasporto dell’ossalato, potrebbe essere responsabile di alcuni dei meccanismi che sottendono alla patogenesi della NCI