Cardiomyocytes generation by programming human pluripotent stem cell fate in microfluidics: from Wnt pathway modulators to synthetic modified mRNA

Le malattie cardiovascolari rappresentano ad oggi una delle principali cause di morbidità e mortalità nel mondo, tra le quali la patologia ischemica è responsable del maggior numero di decessi negli ultimi 10 anni. L’elevato impatto determinato da tali patologie, sia acute che croniche, e gli elevati costi per i sistemi sanitari, richiedono lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. La questione principale riguardante gli attuali approcci terapeutici, sia farmacologici sia interventistici, è rappresentata dalla loro incapacità di compensare l’elevata ed irreversibile perdita di cardiomiociti funzionali. A causa della limitata capacità rigenerativa dei cardiomiociti post-natali e della difficoltà di reperire ed isolare tessuto cardiaco bioptico, scarse sono le fonti di tali cellule disponibili per uno studio dedicato. Tra l’altro, anche se i modelli animali ancora oggi rappresentano sicuramente lo stumento migliore per studiare e comprendere in vivo i meccanismi alla base dello sviluppo di specifiche patologie umane, nel constesto di un organismo complesso, essi non sono completamente predittivi e rappresentativi della condizione umana analizzata; da un punto di vista economico, il mantenimento di tali animali e le relative sperimentazioni, richiedono molto tempo e costi elevati. In questo scenario, le cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs), comprese le cellule staminali embrionali (hESCs) e le cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs), rivestono un ruolo importante nella ricerca cardiovascolare perché possono essere espanse in coltura indefinitamente, senza perdere la loro staminalità, e differenziare nelle cellule che componogono i tre foglietti germinativi, come ad esempio i cardiomiociti. Un’importante svolta nella ricerca scientifica è avvenuta nel 2007, con la scoperta delle hiPSCs da parte del Premio Nobel Shinya Yamanaka. Ciò ha rappresentato il punto di partenza per derivare hiPSCs paziente-specifiche attraverso il reprogramming di cellule somatiche ottenute con procedure mini- o non-invasive (derivate da biopsie cutanee, sangue, urina…), utili per generare tessuti per una riparazione autologa, evitando i problemi etici e politici relativi alla derivazione delle hESCs. Notevoli studi sono stati condotti dai ricercatori nel tentativo di sviluppare strategie che efficientemente ed in maniera robusta guidino il differenziamento cardiaco delle hPSCs, basate sulla perturbazione stadio-specifica di differenti vie di segnalazione, mediante l’uso di fattori di crescita e piccole molecole, che ricapitolano i punti essenziali dello sviluppo cardiaco osservato in vivo. Tuttavia, questi metodi sono accompagnati da alcune limitazioni, quali: elevata variabilità intra ed inter-sperimentale, presenza di xeno-contaminanti, componenti indefinite nei medium di coltura e differenze nei livelli di espressione di citochine endogene. Altre strategie si basano invece sulla conversione diretta di cellule somatiche, specialmente fibroblasti, attraverso l’overespressione di una combinazione di fattori di trascrizione cardiaci mediante vettori integrativi e non-integrativi; tuttavia, anche tali approcci sono caratterizzati da basse efficienze nella generazione di cardiomiociti, associate al rischio di integrazioni genomiche e mutagenesi inserzionale nel caso dei vettori integrativi, o alla necessità di effettuare diversi step di purificazione quando si ultilizzano sistemi non-integrativi. Pertanto, a causa delle difficoltà dei sistemi convenzionali di coltura nel dirigere specificamente ed in maniera robusta il differenziamento cardiaco delle hPSCs, assieme alla scarsa capacità di riprodurre in vitro l’ambiente in cui le cellule risiedono in vivo, i cardiomiociti prodotti attualmente sono immaturi e più simili allo stadio fetale di sviluppo. Nel 2010 Warren L. ed il suo gruppo di ricerca ha sperimentato per la prima volta una tecnologia innovativa di tipo non-integrativo basata su trasfezioni ripetute con lipidi cationici di RNA messaggeri modificati sinteticamente (mmRNA) per evitare la risposta immunitaria innata da parte delle cellule; egli ha dimostrato la possibilità sia di riprogrammare cellule somatiche allo stato pluripotente, sia di programmare il differenziamento miogenico di hiPSCs. Pertanto, lo scopo di questa tesi di dottorato è quello di sviluppare un metodo robusto ed efficiente per il differenziamento cardiaco di hPSCs combinando gli mmRNA con la tecnologia microfluidica. Ripetute trasfezioni di mmRNA codificanti per 6 fattori di trascrizione coinvolti nello sviluppo e nel funzionamento cardiaco, vengono impiegate per forzare l’espressione proteica endogena delle cellule e per guidare il differenziamento verso la maturazione funzionale dei cardiomiociti. L’integrazione del differenziamento cardiaco in una piattaforma microfluidica ad hoc, prodotta nel laboratorio BioERA, consente un controllo più preciso delle condizioni di coltura garantendo un’elevata efficienza di trasfezione degli mmRNA grazie all’elevato rapporto superficie/volume e permette la riproduzione in vitro di nicchie fisiologiche. Infatti, la miniaturizzazione consente di mimare al meglio le dinamiche cellulari che avvengono in vivo nel microambiente solubile. Le tecnologia microfluidica offre la possibilità di effettuare esperimenti combinati, multiparametrici e paralleli in una sola volta e con elevato rendimento a costi ridotti, non realizzabili nei macroscopici e costosi sistemi di coltura convenzionali. Il Capitolo 1 inizia con la definizione di medicina rigenerativa e introduce la complessità dello sviluppo cardiaco ed il network di fattori di trascrizione che cooperano durante questo processo. Viene poi descritto lo stato dell’arte relativo alle strategie per l’ottenimento di cardiomiociti da hPSCs e al transdifferenziamento cardiaco di cellule somatiche, insieme alle relative limitazioni e alle problematiche attuali da risolvere. Infine viene presentato lo scopo generale di questa tesi di dottorato. Il Capitolo 2 si focalizzerà sulle hPSCs (sia hES sia hiPS) impiegate durante questo progetto, descrivendo le caratterisatiche principali di tali cellule. Verrà inoltre presentato un protocollo di differenziamento cardiaco di hPSCs in monostrato che attualmente è considerato il gold standard per ottenere velocemente un’elevata resa di cardiomiociti contrattili in supporti di coltura convenzionali. Tale protocollo si basa sulla modulazione del pathway canonico di Wnt attraverso l’applicazione di due piccole molecole. Inoltre, una linea di hES, doppio reporter per 2 fattori di trascrizione cardiaci, verrà descritta ed impiegata in tutti gli esperimenti come strumento per monitorare l’andamento del differenziamento cardiaco delle hPSC. I risultati ottenuti in colture standard verranno mostrati. Il Capitolo 3 esaminerà lo stato dell’arte della tecnologia microfluidica nelle applicazioni di medicina rigenerativa, sottolineando i vantaggi derivanti dalla combinazione della microtecnologia con la biologia cellulare. Verrà successivamente descritta la fabbricazione della piattaforma microfluidica utilizzata, con la successiva ottimizzazione della coltura, espansione e differenziamento cardiaco gold standard delle hPSCs conseguenti alla conversione dalla macro- alla microscala. Il Capitolo 4 introdurrà la nuova strategia degli mmRNA per la riprogrammazione e la programmazione cellulare: anche in tal caso verrà discusso lo stato dell’arte. In seguito, verranno presentate le strategie sperimentali sviluppate per programmare il differenziamento cardiaco delle hPSCs verso un fenotipo più maturo dei cardiomiociti, insieme ai risultati ottenuti con le relative caratterizzazioni strutturali, funzionali e molecolari. In questo lavoro, per la prima volta, è stato possibile ottenere cardiomiociti da hPSCs attraverso ripetute trasfezioni di mmRNA per 6 fattori di trascrizione cardiaci in microfluidica, con efficienze superiori rispetto ai metodi presenti attualmente in letteratura, svolti in sistemi convenzionali. Il Capitolo 5 infine presenterà la discussione e le conclusioni generali, assieme alle prospettive future riguardanti l’uso degli mmRNA combinati con la microfluidica per ottenere diversi fenotipi di cardiomiociti, variando la combinazione di fattori di trascrizione veicolati. In conclusione, gli esperimenti sviluppati in questo progetto di dottorato forniscono un proof-of-principle della possibilità di programmare con gli mmRNA il destino delle hPSCs verso il differenziamento e la maturazione di cardiomiociti funzionali in microfluidica; inoltre, essendo gli mmRNA una strategia non-integrativa , i cardiomiociti ottenuti in questo modo possono essere impiegati nel prossimo futuro per applicazioni cliniche di ricostruzione tissutale autologa e per screening farmacologici personalizzati.