Metabolomics in natural products research: application to in vivo bioactivity studies involving nutraceuticals

L’analisi del metaboloma urinario e delle sue variazioni può fornire utili informazioni sull’effetto del consumo di prodotti nutraceutici da parte di volontari sani o in modelli animali. I vantaggi di usare l’urina come matrice di studio sono correlati alla scarsa invasività di campionamento, al semplice trattamento pre-analitico dei campioni, alla possibilità di progettare e condurre esperimenti a lungo termine ed alla possibilità di quantificare alcuni markers di stress ossidativo. Sulla base della loro attuale diffusione sul mercato e dei dati di bioattività disponibili in letteratura, per il lavoro di tesi qui presentato sono stati presi in esame tre prodotti nutraceutici, contenenti rispettivamente estratti secchi di Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. (contenente resveratrolo), Vaccinium macrocarpon Aiton (cranberry, contenente proantocianidine di tipo A) e semi verdi di Coffea canephora Pierre ex Froehn. (GCBE, contenente derivati dell’acido clorogenico). Nella prima parte di lavoro sono stati studiati gli effetti del consumo di un estratto secco di Polygonum cuspidatum per 49 giorni in ratti adulti sani, impiegando un approccio metabolomico combinato NMR/UPLC-MS. Per studiare l’effetto “anti-aging” attribuito al resveratrolo, sono stati sviluppati dei modelli multivariati in cui sono stati posti a confronto il gruppo “trattato” ed il gruppo di controllo; da questi sono stati selezionati ed identificati specifici biomarkers di invecchiamento, i quali livelli urinari sono stati poi monitorati per tutto il corso dell’esperimento. Un simile approccio UPLC-MS è stato in seguito impiegato per studiare l’attività ex vivo di un estratto secco di cranberry contro un ceppo di Escherichia coli uropatogenico. In questo caso sono stati disegnati due esperimenti indipendenti, in cui gli effetti del trattamento sono stati studiati rispettivamente in ratti sani ed in volontari umani. Nel primo esperimento è stato somministrato un estratto secco di cranberry standardizzato in procianidine per 35 giorni a ratti Sprague-Dawley, per mimare un consumo prolungato di cranberry da parte di pazienti umani. Settimanalmente è stata effettuata la raccolta delle urine delle 24 ore, ed i campioni raccolti sono stati analizzati mediante un approccio untargeted UPLC-MS. Impiegando lo stesso modello animale, è stata effettuata una singola somministrazione di cranberry e la variazione della composizione urinaria è stata studiata a 2, 4, 8 e 24 ore dopo il trattamento. Gli stessi campioni sono stati utilizzati per testarne le proprietà antiadesive contro Escherichia coli e per determinare i markers urinari correlati all’assunzione di cranberry, grazie all’impiego di tecniche statistiche multivariate ed allo sviluppo di specifici metodi cromatografici atti alla determinazione di PAC-A intatte in matrice urinaria. Nel secondo esperimento, ai volontari umani sani è stato chiesto di consumare un integratore contenente 360 mg di estratto secco di cranberry e 100 mg di quercetina. I campioni urinari sono stati raccolti a 2, 4, 6, 8 e 24 ore a seguito del trattamento e le loro proprietà antiadesive sono state testate contro un ceppo di E. coli uropatogenico. In modo da correlare l’attività biologica osservata in vitro con la modifica composizionale indotta dal trattamento, sono stai impiegati degli approcci LC-MS targeted e untargeted. Infine, è stato condotto uno studio clinico su un piccolo numero di volontari sani per studiare gli effetti di una integrazione con 400 mg di GCBE per 30 giorni. I campioni urinari delle 24 ore sono stati raccolti settimanalmente ed in seguito analizzati mediante LC-MS ed analisi statistica multivariata. Sono state eseguite analisi targeted per quantificare biomarkers urinari di stress ossidativo, al fine di valutare la potenziale attività antiossidante di GCBE in vivo.