Sviluppo e caratterizzazione di nuovi inibitori diretti contro la polimerasi dei virus dell'influenza di tipo A e B

L’influenza è un’infezione respiratoria, di origine virale, caratterizzata da elevata morbidità e mortalità soprattutto in soggetti ad alto rischio (bambini, anziani, pazienti con malattie croniche/debilitanti, ecc.). I virus influenzali di tipo A (IAV) e di tipo B (IBV), caratterizzata da notevole instabilità genetica e variabilità antigenica, sono la causa di epidemie annuali che colpiscono ogni anno il 15-20% della popolazione mondiale. Inoltre IAV è in grado di infettare una grande varietà di uccelli e mammiferi e come accaduto con il recente caso di influenza suina H1N1, un riassortimento genico tra i segmenti genomici virali di differenti specie può verificarsi e causare anche pandemie. Nel secolo scorso, la pandemie di influenza spagnola (1918), l’influenza asiatica (1957) e l’influenza di Hong Kong (1968), hanno causato effetti devastanti, determinando diverse decine di milioni di morti in tutto il mondo. Per questi motivi IAV e IBV rappresentano una grave minaccia per la salute pubblica ed è assolutamente necessario disporre di agenti terapeutici efficaci contro questi virus. Le opzioni terapeutiche attualmente disponibili contro l’influenza includono la vaccinazione e due distinte classi di farmaci rappresentati dagli inibitori di neuraminidasi (NA) e dai bloccanti del canale ionico M2. Tuttavia i vaccini devono essere riformulati ogni anno a causa della variabilità genetica del virus e non sono sempre protettivi. Inoltre, la produzione di un nuovo vaccino richiede vari mesi, quindi è del tutto improbabile che la vaccinazione possa essere efficace nell’impedire la diffusione di una pandemia influenzale rapidamente emergente. Oseltamivir (tamiflu) e zanamivir (relenza) fanno parte degli inibitori di neuraminidasi ed agiscono bloccando il rilascio delle particelle virali dalle cellule infettate. Amantadina (symadine, symmetrel) e rimantadina (flumadine) invece vanno a bloccare il canale ionico della proteina M2, prevenendo la transcapsidazione del virus e quindi il rilascio dei segmenti genomici nel citoplasma. Questi farmaci tuttavia presentano numerosi svantaggi, tra cui considerevoli effetti collaterali, efficacia ridotta, notevoli limitazioni nella somministrazione e soprattutto sono associati ad una rapida emergenza di ceppi virali farmaco-resistenti. Di fatto, non esiste ancora una terapia efficace contro l’influenza e questo rende necessario lo sviluppo di nuovi farmaci, possibilmente dotati di un innovativo meccanismo d’azione. Un interessante bersaglio per lo sviluppo di nuovi farmaci antivirali è rappresentato dall’RNA polimerasi virale, in quanto è un elemento conservato fra i diversi ceppi virali e non è soggetto a riassortimento genico. L’RNA polimerasi virale è un complesso eterotrimerico, costituito da tre proteine (la proteina acida della polimerasi [PA], la proteina basica 1 della polimerasi [PB1] e la proteina basica 2 della polimerasi [PB2]). Queste tre subunità interagiscono fisicamente tra di loro e, in particolare, la subunità PB1 interagisce sia con PB2 che con PA, mentre al momento esistono evidenze di un’interazione tra PB2 e PA. E’ stato dimostrato che l’interazione PA/PB1 è essenziale per la replicazione del virus: infatti l’inibizione di questa interazione causa l’inibizione della polimerasi virale. Il fatto che l’interfaccia di interazione PA-PB1 sia molto conservata tra differenti ceppi di IAV e IBV e che questo legame sia essenziale per la replicazione virale fa sì che esso rappresenti un potenziale bersaglio per lo sviluppo di nuovi composti anti-influenzali ad ampio spettro. Grazie ad uno screening in silico di una libreria di strutture di small molecules, condotto dal nostro gruppo di ricerca, sono stati identificati alcuni composti in grado di dissociare l’interazione tra le subunità PB1 e PA della RNA polimerasi del virus dell’influenza in vitro, a concentrazioni micromolari (Muratore et al., 2012a). Gli stessi composti non mostravano citotossicità in linee cellulari, ma allo stesso tempo esibivano solo modeste attività antivirali contro IAV. Lo scopo di questo progetto è stato valutare le modalità di interazione di questi composti con il bersaglio e sulla base di queste informazioni disegnare degli analoghi strutturali per aumentarne l’attività antivirale, preservando allo stesso tempo l’assenza di citotossicità ed il peculiare meccanismo d’azione. Una volta sintetizzati, questi analoghi sono stati saggiati in vari esperimenti al fine di valutarne appunto la loro capacità di inibire la replicazione virale di IAV mediante saggi di riduzione delle placche (plaque reduction assays, PRA), ma anche determinare il loro effetto inibitorio sull’interazione PA-PB1 in saggi ELISA ed indagare sulla loro eventuale citotossicità su linee cellulare in saggi MTT. In questi saggi, alcuni analoghi si sono messi in luce mostrando delle promettenti attività inibitorie e sono stati selezionati per essere ulteriormente caratterizzati. L’attività dei composti più interessanti è stata confermata mediante minireplicon assay, un saggio cellulare che permette di determinare l’effetto delle molecole sull’attività polimerasica di IAV. Tra questi, i composti 70, T22 e T40 hanno mostrato un effetto inibitorio sull’attività polimerasica virale con valori di EC50 comparabili o addirittura minori a quello ottenuto con la ribavirina (RBV), utilizzata come farmaco di riferimento. E’ stata poi valutata anche l’attività antivirale di questi analoghi nel tempo; quello che è emerso è che tutti i composti mostravano un massimo di attività alle 12 ore post-infezione (p.i.), senza tuttavia perdere l’effetto antivirale neanche a 48 ore p.i. Inoltre gli analoghi più promettenti erano capaci di inibire la replicazione di un pannello di diversi ceppi di IAV e di IBV, incluso un isolato clinico oseltamivir-resistente, dimostrando così di avere un’attività anti-influenzale ad ampio spettro. Al contrario, gli stessi composti non hanno evidenziato alcun effetto inibitorio sulla replicazione di altri virus a DNA e RNA, confermando di possedere uno specifico meccanismo d’azione. Infine per alcuni analoghi promettenti sono stati eseguite delle previsioni e delle simulazioni virtuali di interazione con la cavità di PA ed anche studi in cui è stata valutata l’eventuale variazione o meno di attività inibitoria nei confronti del bersaglio di PA mutato in alcuni residui chiave rispetto a quello wild-type (wt). Questo ci ha permesso di delineare delle relazioni struttura-attività (structure-activity relationships, SAR) e di ottenere preziose informazioni riguardo al modo in cui questi inibitori interagiscono con PA, ricavando di conseguenza utili suggerimenti per il disegno di nuovi analoghi caratterizzati da un miglior adattamento alla tasca di legame e da un’attività ancor più potente. In conclusione, questo studio dimostra le potenzialità di questi composti come inibitori dell’RNA polimerasi dei virus influenzali e nel prossimo futuro saranno saggiati in combinazione con i farmaci anti-influenzali attualmente in commercio per valutare possibili effetti sinergici. Inoltre questo lavoro ha permesso di identificare nuovi scaffold dotati di attività antivirale che saranno ulteriormente studiati per sviluppare una nuova generazione di agenti terapeutici capaci di combattere l’infezione da IAV e IBV.