Integrated analysis of mRNA and miRNA in human differentiating muscle cells

I muscoli sono responsabili dei movimenti del corpo e costituiscono circa metà del peso di una persona. I muscoli scheletrici sono i soli tessuti muscolari volontari, essendo controllati coscientemente. Le cellule del muscolo scheletrico si formano quando diverse piccole cellule progenitrici si conglobano tra loro per formare lunghe affusolate fibre multinucleate. Le cellule muscolari proliferanti sono chiamate mioblasti. I mioblasti si fondono tra loro per formare cellule multinucleate e non proliferanti, chiamate miotubi. La transizione dallo stato proliferante a quello differenziato implica un completo cambiamento del trascrittoma cellulare, basato su una rete di regolazione a livello molecolare. Per scoprire il groviglio di attività molecolari implicate nel processo di differenziamento muscolare è essenziale avere una più profonda ed estesa comprensione del transcrittoma nella sua interezza. L'RNA seq è una tecnologia di sequenziamento massivo che ci offre l'opportunità di accedere ai livelli più approfonditi del trascrittoma. Con la tecnologia dell'RNA seq ho ottenuto una precisa visione del trascrittoma delle cellule muscolari umane, sia allo stadio proliferativo che a quello differenziato. Per avere una visione completa del trascrittoma, l'analisi è stata estesa anche agli small RNA. Ho svolto queste analisi con l'obiettivo specifico di identificare i geni espressi e di evidenziare in particolare quelli differenzialmente espressi, sia per quanto riguarda gli mRNA che i miRNA. Ho anche analizzato il crosstalk tra mRNA e miRNA, impiegando due diversi metodi: sovraespressione dei miRNA e immunoprecipitazione di Ago2, seguita da RNA seq. Gli esperimenti di sovraespressione sono stati condotti con 5 diversi miRNA e in tutti i casi ho trovato più geni che hanno aumentato il loro livello piuttosto di geni che l'hanno diminuito. Questi risultati suggeriscono che i miRNA potrebbero avere un ruolo nella stabilizzazione degli mRNA, oppure potrebbero avere un ruolo in un doppio meccanismo negativo, inibendo a loro volta fattori negativi. Confrontando i geni che diminuiscono di livello dopo la sovraespressione di miRNA con i geni arricchiti dall'immunoprecipitazione con Ago2, abbiamo trovato diversi geni candidati per essere sotto il controllo inibitorio dei miRNA. Il muscolo scheletrico ha una grande plasticità e può sopportare un notevole stress. Per studiare questo aspetto del muscolo abbiamo sottoposto le cellule in differenziamento a stiramento meccanico. Con l'RNA seq abbiamo ottenuto un'approfondita visione del trascrittoma in risposta allo stiramento. Abbiamo effettuato queste analisi a due diversi tempi dopo lo stiramento ed abbiamo trovato che nel periodo immediatamente successivo allo stimolo vengono sovraespressi geni implicati nella risposta immunitaria, mentre successivamente sono attivati i geni codificanti proteine muscolari strutturali, quando allo stesso tempo la risposta immunitaria viene inibita. Sono convinta che la nostra approfondita analisi del trascrittoma che include l'interazione di mRNA e miRNA durante la miogenesi, possa contribuire ad una maggiore comprensione di processi che regolano lo sviluppo muscolare