Human tissue-on-a-chip development for Type 2 Diabetes studies

Il Diabete di tipo 2 insorge da una condizione di insulino-resistenza che colpisce soprattutto il tessuto muscolare e il tessuto adiposo, alterando il loro uptake di glucosio e portando a complicanze cliniche più gravi. È altresì noto che questi tessuti interagiscono tra loro con una comunicazione distruttiva che peggiora la patologia. A causa della sua complessità clinica, il Diabete di tipo 2 richiede spesso trattamenti paziente-specifici. In questo scenario, nasce la necessità di sviluppare un un modello in vitro umano capace di fornire risposte biologiche rilevanti e che sia rappresentativo della patologia in vivo specifica del paziente. L’obiettivo di questa tesi di dottorato è lo sviluppo e l’integrazione di modelli di tessuto umano derivati da pazienti affetti da Diabete di tipo 2 in una tecnologia microfluidica per svolgere screening di farmaci in vitro. Tale modello, permetterà di dissezionare, riprodurre e studiare le interazioni dei tessuti in patologie che coinvolgono più organi. In questo specifico caso, permetterà di investigare l’insulino-resistenza dei tessuti umani sottoposti a stimoli veloci, sia fisiologici che fisio-patologici. Considerato il loro ruolo centrale nell’insorgenza del Diabete, in questa tesi è presentata l’integrazione in una tecnologia “Lab-on-a-chip” di tessuto muscolare e tessuto adiposo. Un modello di mioblasti è stato utilizzato per lo studio delle dinamiche cellulari del glucosio. La tecnologia microfluidica in cui è stato integrato ha permesso di monitorare la concentrazione extracellulare di glucosio con un’alta risoluzione temporale, mantenendo integra nel contempo la coltura cellulare. Inoltre l’uso di un nanosensore intracellulare FRET specifico per il glucosio ha permesso di misurare la concentrazione citosolica del metabolita in mioblasti vivi. Avvalendosi di modellazione matematica e analitica dei dati sperimentali è stato possibile calcolare i parametri cinetici propri del glucosio in una cellula: nello specifico sono state calcolate le cinetiche del trasporto attraverso la membrana citosolica e della fosforilazione intracellulare. Il tessuto adiposo è stato invece integrato come organo-coltura in un chip microfluidico automatizzato, il quale è in grado di fornire stimoli di insulina o farmaci controllati nel tempo, rendendo flessibile la possibilità di sperimentazione. Il tessuto adiposo da parte sua ha mostrato elevate vitalità e attività metabolica, un’alta sensibilità alla portata del medium durante le misure di uptake di glucosio e soprattutto una elevata ripetibilità sperimentale. Infine, viene presentata l’integrazione in dispositivi microfluidici di tessuto muscolare umano accoppiando inoltre tecniche di micropattern per ottenere un migliore controllo della topologia cellulare in vitro. Innanzitutto è stato studiato l’effetto dovuto all’utilizzo di pattern a righe di diverse ampiezze sulla proliferazione e differenziamento dei mioblasti in vitro: maggiore è l’ampiezza delle righe del pattern, minore è la proliferazione e maggiore è il differenziamento. Il miglior pattern (composto da righe di 300 µm), è stato riprodotto all’interno di chip microfluidico. Mioblasti umani coltivati in questo sistema sono stati in grado di differenziare in miotubi caratterizzati da una elevata organizzazione sarcomerica. Inoltre è stato verificato il mantenimento dell’attivazione del pathway dell’insulina, risultato evidenziato adattando convenzionali tecniche di biologia molecolare ai piccoli volumi cellulari coinvolti. Il tessuto muscolare integrato in microfluidica è stato infine studiato sotto lo stimolo di medium condizionato da tessuto adiposo, mostrando l’insorgenza di insulino-resistenza. Questi risultati mostrano un elevato potenziale nel futuro delle sperimentazioni cliniche e farmaceutiche grazie alla possibilità di poter riprodurre in vitro le interazioni multi-organo di patologie complesse. Con il supporto di tali strumenti sarà possibile superare le attuali limitazioni presenti nello sviluppo di nuove terapie. Sarà infatti possibile riprodurre in vitro la patologia, anche in una maniera paziente-specifica, permettendo quindi l’attuazione di terapie personalizzate.