ANALISI DI BIOMARCATORI GENETICI PER PREDIRE LA RISPOSTA IN PAZIENTI CON TUMORE AL RETTO E ALL'ESOFAGO TRATTATI CON CHEMIORADIOTERAPIA NEOADIUVANTE

I tumori gastrointestinali (GI) si riferiscono a condizioni maligne che colpiscono esofago, stomaco, intestino, vescica, fegato e pancreas e vengono considerati complessivamente i tumori con maggiore grado di letalità a livello mondiale. I tumori gastrointestinali rappresentano il 22% di tutti i tumori e la maggiore minaccia per la salute mondiale con il 12% delle morti annuali complessive correlate al tumore. Negli ultimi anni, l'alto grado di incidenza dei tumori GI, in Europa ha stimato più di 250mila nuovi casi e 140mila morti. Sebbene l'incidenza dei tumori gastrointestinali sia diminuita nella parte occidentale del mondo dagli anni 40'-80', rimane in ogni caso un problema per la salute pubblica mondiale. In particolare, in Asia e in alcune parti del Sud America, i tumori gastrointestinali sono il tipo di neoplasie più diffuse e causa di morte. Nonostante i progressi nella diagnosi dei tumori gastrointestinali, alcuni vengono individuati molto tardi a causa di sintomi poco evidenti o metodi di screening poco specifici. La maggior parte dei pazienti vengono diagnosticati all'ultimo stadio, pertanto perdono le oppurtunità di interventi medici precoci e circa il 20-45% di questi vanno incontro a resezione in seguito a ricaduta tumorale o sviluppo di metastasi a causa della natura altamente aggressiva dei tumori. La natura aggressiva di questi tumori è correlata ad un elevato numero di anomalie tra cui l'inattivazione di alcuni geni oncosoppressori, l'attivazione di numerosi oncogeni, riattivazioni di telomerasi e anomalie in diversi fattori di crescita o altri recettori. In particolare, il cancro al retto è considerato uno dei tumori più comunemente riscontrati in tutto il mondo. L'incidenza e l'indice di mortalità variano a seconda dell'area geografica. Negli Stati Uniti si stimano più di 130mila nuovi casi e più di 50mila morti nell'ultimo anno. Nell' Unione Europea , il tumore al retto rappresenta il 35% dei tumori colonrettali; l'incidenza è 15-25/100,000 all'anno e la mortalità è 4-10/100,000 all'anno. Mentre il cancro all'esofago è la sesta tra le cause maggiori di mortalità correlate al tumore e l'ottavo tipo di tumore più diffuso a livello mondiale. Nel mondo 450.000 persone sono affette da tumore all'esofago e la sua incidenza è in aumento. Il tumore all'esofago rappresenta la causa maggiore di morte per cancro nella popolazione maschile mondiale. La prognosi è relativamente sfavorevole con un tasso di sopravvivenza a 5 anni che varia dal 15% al 26% in base al tipo di trattamento; i risultati migliori si hanno con una diagnosi precoce della malattia durante gli stadi iniziali. La resezione chirurgica e la radioterapia rappresentano la terapia curativa per gli stadi precoci di tumore al retto e all'esofago ma una percentuale significativa di pazienti viene classificata come tumore localmente avanzato. In questo gruppo di pazienti, il tumore cresce oltre le pareti del retto o esofago oppure è in grado di invadere gli organi o strutture vicine; in questo caso la chirurgia e la radioterapia sono inadeguate portando ad un maggior rischio di ricaduta locoregionale e sviluppo di metastasi. Negli ultimi anni la combinazione di excisione chirurgica e terapia neoadiuvante prechirurgica è considerata come terapia gold standard per il tumore al retto ed esofageo localmente avanzato. Infatti in più della metà dei pazienti che vengono trattati con chemioterapia, tra cui 5-fluorouracile e/o cisplatino, mostrano un significativo downstaging del tumore iniziale e una riduzione di recidive locali. L'altra metà dei pazienti non è in grado di rispondere in maniera efficace alla chemioterapia. Attualmente non esistono variabili in grado di predire la risposta alla chemioterapia. Esistono però numerose variazioni interindividuali in meccanismi importanti come la riparazione del DNA e il metabolismo dei folati, delle pirimidine e del cisplatino che possono influire sulla resistenza alla radio e chemioterapia. Alcuni polimorfismi di geni conosciuti essere coinvolti in questi pathway sono stati ampiamente descritti in letteratura e sono stati associati con l'outcome del trattamento antitumorale. Ad oggi però non esiste ancora un pannello di polimorfismi in grado di predire l'outcome terapeutico e la maggiorparte degli studi utilizza modelli statistici lineari per analizzare i dati ottendo risultati inconsistenti. Anche per quanto riguarda l'analisi dei genotipi esistono molte divergenze, infatti la statistica lineare non è in grado di valutare l'epistasi ovvero le interazione che normalmente avvengono tra i geni a livello di due o più loci pertanto il fenotipo sarà differente se si considera l'espressione di un gene in maniera indipendente. Questo fenomeno molto frequente deve essere considerato qualora si intraprendano studi di farmacogenetica e la statistica lineare non è in grado di valutare questo aspetto. Il metodo Multifactor Dimensionality Reduction è stato progettato specificamente per identificare le interazioni tra variabili discrete che possono influenzare un outcome binario e attualmente viene sempre più utilizzato in studi di farmacogenetica in quanto il numero delle variabili che si vogliono analizzare è consistente. Questo metodo classifica i genotipi in “risposta” o “non risposta” in modo da ridurre la multidimensionalità dei dati in una sola dimensione, in questo modo è possibile individuare combinazioni genetiche che conferiscano un determinato grado di predittività della malattia. Lo scopo di questo studio consiste nel valutare la correlazione tra alcuni polimorfismi in geni coinvolti nella riparazione del DNA, nel pathway di detossificazione e nel meccanismo di azione e metabolismo dei farmaci antitumorali con l'outcome clinico dei trattamenti radiochemioterapici concomitanti impiegati attualmente come standard in neoadiuvante per i pazienti affetti da tumore al retto e all’esofago. Inoltre, si vuole valutare l’utilizzo di nuovi approcci statistici per individuare correlazioni genotipo-fenotipo. In questo studio sono stati arruolati 70 pazienti con tumore rettale di stadio II e II, di cui 18 femmine e 52 maschi con età media di 62 anni. Tutti i pazienti sono stati trattati per 5 settimane con 300 mg/m2/die di 5-fluorouracile mediante infusione venosa e contemporaneamente con radiazioni 56 Gy, seguito da resezione chirurgica. Le risposte a livello tumorale sono state direttamente valutate sui campioni chirurgici e ordinate secondo la classificazione TNM. I pazienti sono stati considerati come responsivi (se pT0 ovvero in caso di completa scomparsa del tumore e pertanto risposta completa; pT1 o pT2 in caso di risposta parziale) o non responsivi (se pT3 e pT4) Sono stati raccolti i campioni di sangue periferico dei pazienti arruolati e il DNA genomico è stato estratto da linfociti di sangue periferico mediante kit commerciale Wizard Genomic (Promega). Il DNA così ottenuto è stato utilizzato per l'analisi dei genotipi di ERCC1, XPD, XPA, XPC, XRCC1, XRCC3, UMPS, MTHFR677, MTHFR1298, TYMS 3'UTR and TYMS 5'VNTR mediante PCR-RFLP. In particolare abbiamo analizzato i seguenti SNPs: XRCC1 Arg399Gln (rs25487), MTHFR 677 C>T (rs1801133), MTHFR 1298 A>C (rs1801131),TYMS 3'UTR 1494del6 (rs34489327), TYMS 5'UTR 28bp (rs34743033), TYMS 5'UTR G/C (rs2853542), XPC Lys939Gln A>C (rs2228001), XPD (ERCC2) A>C (rs121913019), ERCC1 C>T (rs121913027), XRCC3 Thre241Met G>A (rs861539), UMPS T>C (rs10049380). La scelta dei polimorfismi da analizzare si è basata sulla ricerca degli stessi su dbSNP di NCBI in base alle frequenze genotipiche nella nostra popolazione. I genotipi sono stati correlati con gli outcome del tumore dopo chemioradioterapia considerando sia la risposta completa ovvero T0 vs T1-4 sia quella maggiore ovvero T0-2 vs T3-4. Per quanto riguarda il set di pazienti con tumore esofageo, sono stati arruolati 124 pazienti con tumore esofageo localmente avanzato e della giunzione gastroesofagea (GEJ) (T2-T4 con o senza linfonodi positivi) e trattati con CRT neoadiuvante. Tutti i pazienti hanno ricevuto settimanalmente docetaxel (35mg/m2) e cisplatino (25mg/m2), infusione protratta di fluorouracile (150mg/m2/die), radioterapia concomitante (50Gy) e successivamente intervento chirurgico radicale. Sono stati raccolti i campioni di sangue periferico dei pazienti arruolati e il DNA genomico è stato estratto da linfociti di sangue periferico mediante kit commerciale Wizard Genomic (Promega). Il DNA così ottenuto è stato utilizzato per l'analisi PCR- RFLP dei seguenti polimorfismi dei geni coinvolti nella riparazione del DNA (XPA-rs1800975, XPC-rs2228000, XPC-rs2228001, XPD-rs13181, XRCC1-rs25487, XRCC3-rs861539, ERCC1-rs11615), nel meccanismo del farmaco (MTHFR-rs1801133, TYMS-rs34743033, UMPS-rs1801019) e nella detossificazione (MDR1-rs2032582, GSTP1-rs1138272). Le risposte a livello tumorale sono state direttamente valutate sui campioni chirurgici e ordinate secondo la classificazione TNM. La risposta patologica completa (CR) è stata definita come assenza di tumore (ypT0N0); la risposta patologica quasi completa (nCR) è stata definita come presenza di microfoci di cellule tumorali nel sito primario con linfonodi negativi; i restanti pazienti sono stati classificati come non responsivi (NR). I pazienti CR ed nCR sono stati classificati invece come responsivi. La cancer specific survival (CSS) è stata definita come il tempo tra la diagnosi e la morte causata dal tumore; il relapse free survival (RFS) è stato definito come il tempo tra l'inizio della terapia e la prima evidenza di ricaduta della malattia. Le curve di sopravvivenza sono state calcolate con il metodo Kaplan-Meyer e confrontate utilizzando il log rank test. Le analisi statistiche sono state eseguite con il test chi quadro, regressione logistica e con il metodo Multifactor Dimensionality Reduction. I pazienti con tumore al retto che hanno risposto alla radiochemioterapia a livello tumorale sono stati suddivisi nel seguente modo: pT0 (pazienti in cui la massa tumorale era completamente sparita) 25,7%, pT1-pT2 (pazienti in cui la massa tumorale si era notevolmente ridotta ma non scomparsa del tutto) 34,3% e pT3-4 (pazienti in cui la massa tumorale era rimasta invariata o quasi dopo trattamento con cherioradioterapia) 40%. Pertanto poco meno della metà dei pazienti non hanno risposto al trattamento, in accordo con i dati di letteratura. Le genotipizzazioni di tutti i pazienti sono state correlate con la risposta patologica. L'analisi statistica con il test chi quadro non ha mostrato nessuna correlazione tra genotipi e risposta patologica. E' stato eseguito anche il test di regressione logistica e non sono state osservate correlazioni tra genotipo, età, sesso e risposta patologica. Al contrario invece, utilizzando il metodo MDR abbiamo dimostrato una correlazione significativa tra la combinazione delle varianti genetiche XRCC1/MTHFR677 e la risposta maggiore (p=0,0009) che è stata correttamente predetta nel 77,8% dei pazienti. Per quanto riguarda i pazienti con tumore esofageo, le analisi univariate mostrano che i genotipi MTHFR 677TT, MDR1 2677GT, GSTP1 114CC, XPC 499CC, e XPC 939AC+CC sono associati a un ridotto RFS con p value ≤ 0.1 e pertanto sono state definite come varianti ad alto rischio. Un modello che include questi 5 polimorfismi ha discriminato tre sottogruppi numericamente simili, portatori di 0-2 (n=48), 3 (n=38) e 4-5 (n=34) genotipi ad alto rischio, per i quali è stato calcolato un RFS a 5 anni di 67.1%, 50% e 20.9% (p=0.0002) rispettivamente e un CSS a 5 anni di 71.1%, 55.8% e 25.8% (p=0.0003) rispettivamente. Nel momento in cui il pannello di 5 SNPs è stato combinato con i dati istologici, le analisi hanno suddiviso i pazienti in due set principali con RFS a 5 anni dal 61% al 75% e dal 22% al 36%. In particolare, RFS a 5 anni era differente nel gruppo di pazienti con 3 varianti ad alto rischio e in accordo con l'istologia: 61% nei pazienti con tumore squamoso e 36% nei pazienti con adenocarcinoma (p=0.06). Globalmente, due classi di rischio potrebbero essere ottenute con i seguenti valori di RFS e CSS a 5 anni 65% vs 27% (HR 3.0, 95% CI 2.0-6.0, p<0.0001 e 69% vs 31% (HR 2.9, 95%CI 1.8-5.7, p<0.0001). La combinazione di risposta patologica con in pannello di 5 SNPs ha permesso la ridistribuzione di tutti i gruppi nelle due classi di rischio maggiormente informative: alto rischio (47.5% dei pazienti, inclusi tutti i NRs e nCRs con 3-5 genotipi sfavorevoli) e basso rischio (52.5% dei pazienti, inclusi tutti i CRs e nCRs con 0-2 genotipi sfavorevoli). Questi due gruppi hanno outcome statisticamente differenti: PFS a 5 anni 79.4% vs 17.7% (HR 6.71, 95% CI 3.98-12, p<0.0001) e CSS a 5 anni 79.3% vs 26.3% (HR 6.25, 95%CI 3.6-11.5, p<0.0001). La procedura di validazione interna mediante MDR ha confermato i nostri modelli come buoni predittori. Infine, oltre al pannello sono stati valutati i singoli polimorfismi in associazione con la risposta patologica per entrambi I set di pazienti, tumore all’esaofago e al retto, mediante analisi univariata. Il polimorfismo XPC Lys939Gln è stato significativamente associato alla risposta patologica: I pazienti con il genotipo wild type nell’84.1% dei casi hanno raggiunto una risposta patologica completa o maggiore rispetto al 52.6% e 40% dei pazienti eterozigoti o Gln omozigoti (p=0.0006). Nessun’altra associazione significativa è stata trovata con gli altri SNPs. Per quanto riguarda invece il set di pazienti con tumore al retto, a conferma di quanto detto sopra, le analisi univariate non hanno rilevato nessuna relazione statistica significatica tra la risposta patologica e gli SNPs, nemmeno con XPC Lys939Gln, predittivo di risposta invece nelle neoplasie esofagee; in questo caso il polimorfismo non era associato ad una significativa riduzione della massa tumorale nelle forme rettali (p=0.37). In conclusione, i nostri dati hanno dimostrato il ruolo di un pannello a 4/5 SNPs nel predire PFS e CSS in pazienti che hanno ricevuto lo stesso protocollo di terapia neoadiuvante chemioterapico. I polimorfismi di XPC, MDR1, GSTP1 e MTHFR meritano ulteriori valutazioni per guidare meglio le decisioni terapeutiche in pazienti con queste caratteristiche. Il polimorfismo XPC 939 è associato alla risposta patologica nei pazienti con tumore all’esofago ma non nei pazienti con tumore al retto. Inoltre, i nostri risultati ci permettono di affermare che l'epistasi dovrebbe essere sempre considerata nel momento in cui si analizzano associazioni farmacogenetiche. Il Multifactor Dimensionality Reduction è un metodo semplice e molto valido per individuare le combinazioni genetiche in grado di identificare quei pazienti con tumore al retto con un alta probabilità di rispondere in maniera soddisfacente alla chemioradioterapia.