Breeding F1 Hybrid Varieties of Leaf Chicory Through Marker-Assisted Selection Schemes

Il genere Cichorium (Cichorium intybus subsp. intybus var. foliosum L.) comprende specie vegetali diploidi (2n=18) appartenenti alla famiglia delle Asteraceae. Queste specie sono generalmente biennali o, in natura, perenni. Si tratta di specie prevalentemente allogame a causa di un efficiente sistema di autoincompatibilità sporofitica. Inoltre, la fecondazione incrociata è favorita da una morfologia fiorale sfavorevole all’autofecondazione, se in assenza di un impollinante (ad esempio la proterandria, ovvero la presenza di antere mature prima dei pistilli). In specie di questo genere si riscontra, inoltre, una forte competizione gametofitica, ovvero il rigetto di polline geneticamente simile a quello prodotto dal parentale femminile. A lungo apprezzate come piante medicinali dagli antichi Greci e Romani, le specie del genere Cichorium sono attualmente tra le più importanti specie orticole coltivate. Sono generalmente utilizzate nella preparazione di insalate fresche o, più raramente, cucinate secondo le tradizioni alimentari locali. Anche se la coltivazione della cicoria non contribuisce largamente all’introito agricolo totale di ogni paese, questa risulta essere molto importante a livello locale, in quanto caratterizza l’agricoltura di aree limitate dove è concentrata la coltivazione dell’80-90% della produzione nazionale di questa coltura. Questo è in effetti il caso dell’Italia dove, il 66% dell’ettarato e il 59% della produzione nazionale di una cicoria da foglia rossa o variegata conosciuta come “Radicchio” è concentrata in Veneto. La produzione di Radicchio è stata per un lungo periodo basata su popolazioni mantenute dagli agricoltori, che venivano di anno in anno selezionate e il cui seme veniva solitamente riutilizzato all’interno del centro aziendale o poteva venir venduto attraverso transazioni private e solitamente non ufficiali. Tutte queste popolazioni, ottenute per selezione massale e mantenute attraverso l’interincrocio di parentali selezionati, devono essere considerate altamente eterozigoti e geneticamente eterogenee; il comportamento e il livello di adattamento di queste popolazioni ai diversi ambienti e condizioni agronomiche, è funzione della frequenza di geni favorevoli e della loro combinazione. In ogni programma di miglioramento genetico, gli schemi e i metodi di selezione che possono essere adottati e le tipologie varietali che possono venir costituite, dipendono dalle barriere riproduttive delle piante (come l’autoincompatibilità), dai sistemi di impollinazione (ad esempio l’allogamia) così come dalla struttura genetica delle popolazioni. La forte autoincompatibilità rinvenuta in cicoria, rende estremamente difficile l’ottenimento di parentali altamente omozigoti nell’ottica di un efficiente schema di ottenimento di ibridi F1. Nonostante le difficoltà incontrate nell’ottenimento di linee inbred attraverso cicli ripetuti di autofecondazione, la recente scoperta di mutanti maschiosterili spontanei ha aumentato l’interesse verso la produzione di varietà ibride F1. La maschiosterilità, o l’incapacità delle piante di produrre polline funzionale, è utile per la produzione di seme ibrido commerciale, attraverso l’incrocio di linee inbred parentali appropriatamente selezionate attraverso test di progenie, per stabilire l’attitudine alla combinazione specifica. In questo progetto abbiamo sviluppato un metodo di genotipizzazione utilizzando marcatori molecolari, utile per stabilire il grado di omozigosi e la stabilità genetica di singole linee inbred e per la misurazione dell’attitudine alla combinazione specifica tra linee portaseme ed impollinante sulla base della loro diversità genetica. Queste informazioni possono essere utilizzate per programmare incroci e predire l’eterosi di ibridi F1 sperimentali sulla base della distanza genetica della linee parentali. Conoscendo il genotipo dei parentali, saremo in grado non solo di proteggere ogni nuova varietà rilasciata sul mercato ma anche di stabilire il grado di purezza e identità varietale del seme ibrido commerciale e di certificare l’origine dei suoi derivati alimentari. La costituzione di varietà ibride F1 vigorose e stabili si avvarrà del breeding moderno assistito da marcatori utilizzando tecnologie quali marcatori SSR e SNP, senza alcun collegamento con tecniche di l’ingegneria genetica, combinando tratti di qualità, uniformità e produttività all’interno degli stessi genotipi. Inoltre, nell’ambito di questo progetto di ricerca abbiamo trattato la scoperta e la caratterizzazione genetica di quattro mutanti maschiosterili in questa specie. Questi mutanti, che da quanto ci risulta dalle informazioni in nostro possesso sono i primi mutanti maschiosterili spontanei mai scoperti e descritti in Radicchio, sono stati dettagliatamente caratterizzati per la via metabolica dello sviluppo della microsporogenesi e gametogenesi e per il modello di ereditarietà del gene responsabile della maschiosterilità. Abbiamo sviluppato un saggio diagnostico basato su marcatori molecolari per la selezione precoce di genotipi associati a piante maschiosterili. In questo modo si è dimostrato che i mutanti maschiosterili oggetto di questo progetto di ricerca sono controllati da un singolo gene nucleare (ms1) che agisce allo stato recessivo. Siamo stati in grado di mappare il gene responsabile della maschiosterilità in una regione cromosomica satura e ben caratterizzata di circa 7.3 cM e 5.8 cM dal locus ms1. Complessivamente queste informazioni saranno fondamentali per la pianificazione di un esperimento di Genotyping-by-Sequencing basato su una popolazione BC1 con l’obiettivo di restringere la finestra genomica contenente il gene responsabile della maschiosterilità in cicoria da foglia. Infine il sequenziamento e l’assemblaggio della prima bozza del genoma di cicoria da foglia discussi in questo studio, contribuiranno ad aumentare e rafforzare la credibilità delle ditte sementiere italiane e delle attività locali in Veneto correlate alla coltivazione e la commercializzazione del Radicchio e prodotti alimentari connessi; il mercato sementiero di questa specie avrà la possibilità di diventare altamente professionale e fortemente competitivo a livello nazionale ed internazionale. Abbiamo assemblato una bozza del genoma della misura stimata di 760 Mb. Abbiamo ottenuto 58.392.530 e 389.385.400 sequenze grezze rispettivamente attraverso le piattaforme di sequenziamento MySeq e HiSeq. Abbiamo identificato complessivamente 66.785 regioni contenenti motivi SSR. Abbiamo riportato i dati bioinformatici di assemblaggio della prima bozza del genoma di Radicchio, insieme ai dati più salienti provenienti da una predizione genica de novo e da una annotazione funzionale in silico di più di 18.000 unigenes. La scoperta del genoma di Radicchio significa l’ottenimento di una base scientifica solida e una conoscenza tecnologica tale da giocare in breve tempo un ruolo cruciale nella risoluzione di problematiche legate alla protezione e la coltivazione di moderne varietà di Radicchio. Siamo fiduciosi che i nostri sforzi amplieranno l’attuale conoscenza dell’organizzazione del genoma e della composizione genica della cicoria da foglia, che si ritengono essere fondamentali nello sviluppo di nuovi strumenti e saggi diagnostici basati su marcatori molecolari utili alle strategie di costituzione varietale e che permettano studi più specifici di tratti cromosomici che controllino aspetti agronomici rilevanti in questa specie. In conclusione, il presente lavoro è da leggersi come una sorta di manuale per meglio capire il mondo di una specie non modello come la cicoria da foglia, orientato prevalentemente verso i costitutori genetici e i produttori di sementi di cicoria.